蒺藜苜蓿膜聯蛋白家族基因在非生物脅迫下的表達分析

程婕 徐柳根 邱濤濤

摘要 膜聯蛋白（Annexin）是一種磷脂結合蛋白，目前有關蒺藜苜蓿膜聯蛋白家族的研究較少。對蒺藜苜蓿膜聯蛋白家族基因進行了生物信息學分析，確定了膜聯蛋白家族基因的數量、結構域和進化關系。對蒺藜苜蓿的幼苗分別進行干旱、鹽和冷處理，并利用高通量測序對20個蒺藜苜蓿膜聯蛋白基因進行表達分析，結果表明：在干旱脅迫下，3個基因表達下調;在鹽脅迫下，5個基因表達下調，4個基因表達上調;在冷脅迫下，3個基因表達下調。其中，MtANX3在各脅迫下均發生了下調。綜上所述，非生物脅迫影響了蒺藜苜蓿模聯蛋白家族基因的表達。

關鍵詞 蒺藜苜蓿;膜聯蛋白;非生物脅迫;基因表達

中圖分類號 S188 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）21-0115-04

Abstract Annexin is a phospholipid binding protein. There are few studies on the Medicago truncatula annexin family. In this paper，bioinformatics analysis of M.truncatula ?annexin family genes was carried out，and the number，domain and evolutionary relationship of annexin family genes were determined. The M.truncatula seedlings were treated with drought，salt and cold stress，and the expression of 20 M.truncatula annexin genes was analyzed by highthroughput sequencing. The results showed that under drought stress，3 genes were downregulated. Under salt stress，5 genes were downregulated and 4 genes were upregulated. Under cold stress，3 genes were downregulated. Among them，MtANX3 were all downregulated under various stresses. In summary，abiotic stress affects the expression of M.truncatula annexin family genes.

Key words Medicago truncatula;Annexin;Abiotic stress;Gene expression

基金項目 江西省教育廳科技計劃項目（GJJ170276）。

作者簡介 程婕（1994—），女，江西贛州人，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學。 *通信作者，教授，從事植物分子生物學研究。

收稿日期 2019-11-28;修回日期 2019-12-18

膜聯蛋白是在1978年發現的一種Ca2+和磷脂結合型蛋白[1]，后續發現其能明顯促進依賴Ca2+的胞吐作用[2-3]。膜聯蛋白是一種多功能性蛋白，在生物體內分布很廣，它可以分布在除酵母菌外的所有真核生物中。而根據生物種類的不同，膜聯蛋白可以分為A、B、C、D、E五類。脊椎動物蛋白是A類，無脊椎動物蛋白屬于B類，真菌和一些單核細胞生物被歸屬于C類，D類包含植物膜蛋白，原核生物屬于E類[4]。不同膜聯蛋白基因的表達模式以及蛋白質的亞細胞定位具有特異性[5-7]。

膜聯蛋白在生物體內具有許多重要作用，但目前的研究主要集中在動物和植物上。在動物體內，已有研究證明，膜聯蛋白具有參與細胞分泌[8]、生物膜的形成和調節離子通道的作用，還與細胞凋亡等生命活動有關[9]。目前，有多個研究膜聯蛋白在癌癥方面作用的內容，如發現在動物體內，膜聯蛋白通過纖溶酶原產生纖溶酶，可以促進細胞外基質降解，促進細胞的遷移和腫瘤的侵襲[10-11]。

在植物方面，膜聯蛋白基因在植物體生長發育的各個階段均有表達[12]，也發揮了各種作用：參與細胞分泌、胞吐作用，與Ca2+形成離子通道，有一些還具有酶的作用[13-14]。植物膜聯蛋白還參與調控植物代謝和生長發育并可以協同調節抗旱、耐鹽等多種抗逆反應[15-17]，在干旱、冷害和高鹽等非生物脅迫下，參與調控植物生命活動，且膜聯蛋白的表達調控會因物種的不同而出現差異[18]。還有研究表明植物膜聯蛋白與根毛和花粉的生長發育以及信號轉導有關系[19-20]。

筆者鑒定了蒺藜苜蓿中膜聯蛋白家族成員，并對其結構域和進化關系進行分析。最后，通過高通量測序分析了該家族基因在高鹽、干旱和冷害脅迫下的表達情況。這一研究初步闡明了蒺藜苜蓿膜聯蛋白家族的脅迫表達情況，將有助于在豆科植物中解析膜聯蛋白在非生物脅迫下發揮的潛在調節作用，為該家族的基因功能鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 苜蓿培養與樣品處理

用Hoagland營養液水培苜蓿4周。培養條件：光周期14/10 h（日/夜），溫度22～24 ℃，光合有效輻射200 μmol/（m2·s）。分別進行干旱處理（將小苗置于濾紙），鹽處理（300 mmol/L NaCl溶液）和冷處理（4 ℃）0、2、6、12 h。TRIzol法提取樣品總RNA，送公司進行高通量測序。

1.2 苜蓿膜聯蛋白家族基因鑒定

在PFAM數據庫（http：∥pfam.xfam.org） 獲得蒺藜苜蓿膜聯蛋白基因家族的結構域模型（PF00191），利用Hmmer 3.0程序（http：∥hmmer.janelia.org/）進行比對、篩選。將篩選得到的候選基因到PFAM數據庫中進行比對，確認最終的膜聯蛋白。

1.3 苜蓿膜聯蛋白基本信息和結構域分析

在蛋白質的數據庫Swiss-Prot（http：∥www.uniprot.org/uniprot/？query=reviewed%3Ayes） 中獲得膜聯蛋白家族基因的基本信息，包括等電點、氨基酸數、相對分子質量等。從PFAM數據庫中獲得這20個基因的結構域圖譜。

1.4 構建進化樹和基因芯片圖譜

首先，用ClustalW程序對膜聯蛋白氨基酸序列進行比對，然后通過MEGA7程序，用鄰接法（Neighbor-Joining）構建進化樹，步長設為1 000。從苜蓿芯片網站（https：∥mtgea.noble.org/v2/index.php）獲得已知芯片信息，用MeV4.0做成熱圖。

2 結果與分析

2.1 蒺藜苜蓿膜聯蛋白的基本信息

通過HMMER軟件在苜蓿蛋白數據庫中比對搜索，然后通過PFAM網站確定，共發現了20個膜聯蛋白。蛋白的氨基酸數分布在96～320，其中，MtANX14氨基酸數最少，只有96個;MtANX10最多有320個。蛋白的分子量分布在10.86～36.83 kD，而等電點分布在4.67～9.43，大部分等電點偏中性，等電點最大的是MtANX20，最小的是MtANX1（表1）。通過PFAM搜索發現，這20個蛋白質都含有ANX結構域，而不含其他結構域。

2.2 膜聯蛋白的進化樹分析

對蒺藜苜蓿膜聯蛋白的20個基因進行系統分析。用ClustalW程序校對得到膜聯蛋白的氨基酸序列，使用MEGA7.0用Neighbor-Joining格式構建進化樹（圖1）。從圖中可以看出，MtANX5和MtANX17，MtANX18和MtANX19，MtANX1和MtANX9，MtANX3和MtANX11，MtANX12和MtANX13，這5對蛋白質之間的親緣關系很近。

2.3 膜聯蛋白家族基因在非生物脅迫下的差異性表達

為了探明膜聯蛋白基因在非生物脅迫下的表達，分別對幼苗進行干旱處理，鹽處理和冷處理0、2、6、12 h，提取總RNA，進行高通量測序。將脅迫處理與非處理的樣品進行比較，如果不同脅迫處理時間點的表達變化一致，并且至少有一個滿足條件|log2N|>1，就把它定義為差異表達基因。結果顯示：MtANX4、MtANX9、MtANX15和MtANX16在鹽脅迫中上調（表3）;MtANX3、MtANX5和MtANX10在干旱脅迫中下調（表2）;MtANX1、MtANX3、MtANX5、MtANX13和MtANX18在鹽脅迫中下調（表3）; MtANX3、MtANX7和MtANX19在低溫脅迫中下調（表4）。

2.4 膜聯蛋白基因組織表達分析 為了分析苜蓿中膜聯蛋白基因組織表達，從已知芯片數據庫中下載數據，利用Mev4.0構建熱圖。結果顯示：MtANX14和MtANX17在植物體各部分的表達都較低，MtANX5 、MtANX18、MtANX19和 MtANX20在植物的根和種子中表達較高，MtANX9在各組織中表達都較高。MtANX6、MtANX7、MtANX18、MtANX19和 MtANX20在根瘤中表達較高，而MtANX14和MtANX17在根瘤中表達很低（圖2）。

3 討論與展望

通過生物信息分析，首次鑒定了20個蒺藜苜蓿膜聯蛋白。這20個蛋白的基本信息顯示大部分蛋白的氨基酸數為300多個，并且等電點偏中性。這些特征可能與膜聯蛋白發揮的細胞分泌、胞吐作用、與Ca2+形成離子通道等功能相關。通過結構域分析，發現這個家族蛋白的結構域非常單一，只有ANX結構域。這一結果說明該家族蛋白可能在功能上比較保守。通過進化樹分析，發現這20個膜聯蛋白有5組親緣關系非常相近，這說明可能膜聯蛋白存在著功能的冗余。

進一步通過高通量測序發現這些蛋白基因中有很多受到非生物脅迫的調控。在干旱脅迫下，3個基因表達下調;在鹽脅迫下，5個基因表達下調，4個基因表達上調;在冷脅迫下，3個基因表達下調。其中，MtANX3在各脅迫下均發生了下調。說明非生物脅迫對膜聯蛋白家族基因的表達有影響。

首次在豆科模式植物苜蓿膜中鑒定了膜聯蛋白家族基因。這一研究將有助于進一步在豆科植物中闡明膜聯蛋白在非生物脅迫下發揮的潛在的調節功能。

參考文獻

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