響應面法優化野金柴總黃酮超聲輔助提取工藝及其不同組分抗氧化能力研究

李洪安,李夏嘉龍,鄧澤元,江和棟,李紅艷

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

野金柴,是殼斗科櫟屬植物多穗石柯(LithocarpuspolystachyusRehd)的干燥葉[1],又名多穗柯。廣泛分布于長江南部,尤以江西、福建、湖南、廣西等省最為廣泛[2]。野金柴中富含黃酮類化合物[3],其中,根皮苷具有強烈的甜味,甜度可達蔗糖的300倍[4],一般應用于生產茶飲料,根皮苷有較高的抗氧化能力[5],在食品生產中有較高的利用價值。金弘昕等[6]對野金柴的化學組分進行了分離鑒定,研究表明,野金柴黃酮類物質除根皮苷外,還有槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、3-羥基根皮苷、山柰酚3-O-α-L-鼠李糖苷幾種黃酮化合物,未對其活性進行進一步研究;單思聰等[7]的研究表明,多穗柯總黃酮具有較好的抗氧化能力,陳陽[8]的研究證實多穗柯根皮苷具有一定的抗氧化作用。但目前除根皮苷外,尚未見關于野金柴中其他黃酮類化合物研究利用的報道。

目前,對于野金柴中黃酮類化合物的提取,大多采用加熱回流、長時間浸提等方法,但此類方法存在提取時間長、效果不佳、消耗溶劑量大等缺點,提取時的高溫還可能破壞野金柴中的功能性成分。相比之下,超聲輔助提取具有高效、消耗溶劑量小、綠色環保等優點[9]。超聲波在液體介質中能產生空化效應,能有效地破壞包埋結構的外層,加速功能成分的溶出,從而提高提取效率。在超聲提取過程中,液料比、乙醇濃度、功率、超聲時間等因素對得率有較大的影響。

本文以野金柴為原料,采用響應面法優化野金柴總黃酮的超聲輔助提取工藝,并用ADS-7大孔樹脂分離總黃酮中的根皮苷,進而對比總黃酮、根皮苷、黃酮R(除去根皮苷后的剩余黃酮組分)的抗氧化能力,為野金柴中黃酮類化合物的綜合利用提供基礎數據,提高野金柴的生產利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野金柴 殼斗科櫟屬植物多穗石柯(LithocarpuspolystachyusRehd)的干燥葉,江西葉苷清生物科技有限公司提供;蘆丁(生化試劑≥98%)、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、VC和Trolox 阿拉丁化學試劑有限公司生產;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀 分析純,天津大貿公司;鹽酸、無水乙醇 分析純,西隴科學公司。

DGG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;AR323CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司;TDL-5-A飛鴿牌臺式離心機、FW80高速萬能粉碎機 上海安亭科學儀器廠;GA92-IID超聲波粉碎機 無錫市上佳生物技術有限公司;722G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;ELx800光吸收酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;EZ-L100-P200中壓制備系統 利穗科技(蘇州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野金柴預處理 將野金柴樣品放入恒溫干燥箱內60 ℃烘干至恒重,粉碎,過60目篩,收集粉末,密封,低溫保存。

1.2.2 野金柴總黃酮提取 精確稱取適量野金柴粉末,加一定濃度乙醇溶液混合均勻,靜置10 min,按照設定好的條件,進行超聲波輔助提取,提取液4200 r/min離心6 min,離心后取上清液待測。

1.2.3 野金柴中總黃酮的測定

1.2.3.1 繪制蘆丁標準曲線 精密稱取12.5 mg蘆丁標準品于25 mL容量瓶中,用75%乙醇定容,即得0.5 mg/mL的蘆丁標準溶液,精確移取標準溶液0、0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、1.75 mL于10 mL容量瓶中,分別加入5% NaNO2溶液0.4 mL,搖勻靜置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL,搖勻靜置6 min,加4% NaOH溶液4 mL,加無水乙醇定容,搖勻靜置10 min,按照分光光度法,在510 nm處測吸光度A[10],以吸光度A為縱坐標,蘆丁質量濃度C為橫坐標繪制標準曲線。得到標準曲線方程為A=13.04435C-0.00287,R2=0.9996。

1.2.3.2 黃酮得率計算 精密吸取野金柴黃酮提取液0.5 mL于10 mL容量瓶中,按上述方法測定樣品中總黃酮含量。按照以下公式計算得率(F):

式中:C為由回歸方程計算出黃酮的濃度,mg/mL;N-稀釋倍數;V-提取液體積,mL;M-稱取的野金柴粉末質量,g。

1.2.4 野金柴總黃酮提取單因素實驗 高溫易改變黃酮類物質活性,且不利于調控,因此固定提取溫度30 ℃,同時其余因素不變,考察乙醇濃度、液料比、功率、超聲時間等單因素對野金柴總黃酮得率的影響,每組實驗重復三次。

1.2.4.1 乙醇濃度對黃酮得率的影響 在液料比30∶1、功率500 W、超聲時間30 min的條件下,分別考察乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%對野金柴黃酮得率的影響。

1.2.4.2 液料比對黃酮得率的影響 在乙醇濃度70%、功率500 W、超聲時間30 min的條件下,分別考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1對野金柴黃酮得率的影響。

1.2.4.3 超聲功率對黃酮得率的影響 在乙醇濃度70%、液料比30∶1、超聲時間30 min的條件下,分別考察功率300、400、500、600、700 W對野金柴黃酮得率的影響。

1.2.4.4 超聲時間對黃酮得率的影響 在乙醇濃度70%、液料比30∶1、功率500 W的條件下,分別考察提取時間20、30、40、50、60 min對野金柴黃酮得率的影響。

1.2.5 響應面優化試驗 根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理,基于單因素實驗結果,以液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲功率(C)、超聲時間(D)為響應因素,編碼水平為-1、0、1,野金柴黃酮得率(F)為響應值,采用四因素三水平的響應面分析法進行實驗設計[11],因素水平設計見表1。

表1 響應曲面試驗因素水平設計

1.2.6 大孔樹脂法分離總黃酮中的根皮苷

1.2.6.1 大孔樹脂的預處理 按李斌等[12]的方法對大孔樹脂進行預處理。

1.2.6.2 吸附與洗脫 用野金柴總黃酮提取液對預處理好的大孔樹脂進行浸泡,并采用常規濕法裝柱,使其自然沉降不留氣泡,并靜態吸附10 h。采用EZ Purifier中壓制備系統進行自動吸附洗脫,同時配備紫外分光光度檢測器進行自動檢測分離。以3 BV的流速進行上樣動態吸附0.5 h,共計上樣500 mL。之后使用70%乙醇溶液以2 BV的流速進行洗脫1 h,并設定在紫外吸收285 nm處收集根皮苷溶液[13];之后再用75%、85%、95%乙醇溶液以2 BV的流速各洗脫0.5 h,將樹脂內剩余吸附物質全部洗出。70%乙醇洗脫2 BV可將大多數根皮苷洗下,之后的遞增梯度洗脫可將剩余黃酮物質洗脫[14]。洗脫液進入紫外分光光度檢測器中,設定根皮苷收集波長為285 nm[15],收集閾值300 mAU,自動收集器采用多管收集的方式將洗脫液收集,在285 nm下無吸收的其他組分則流入回收裝置,完成對根皮苷與黃酮R的分離。參考金弘昕等[6]的結論,野金柴黃酮類物質除根皮苷外,還含有槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、3-羥基根皮苷、山柰酚3-O-α-L-鼠李糖苷,故黃酮R即為上述黃酮物質的多組分溶液。

1.2.6.3 濃縮與收集 將純化的根皮苷溶液、總黃酮溶液、黃酮R溶液分別經旋蒸濃縮,氮吹后收集。

1.2.7 抗氧化活性研究

1.2.7.1 DPPH自由基清除率的測定 以維生素C(10、15、20、25、30、35、40 mg/mL)作為陽性對照,分別檢測10、15、20、25、30、35、40 mg/mL濃度的野金柴黃酮提取液、黃酮R溶液、純化根皮苷溶液對0.2 mmol/L DPPH溶液的自由基清除率。分別測定VC和三種溶液對DPPH自由基的清除率,清除率越高表明清除自由基的能力越強,即抗氧化能力越強。精密吸取100 μL的野金柴黃酮提取液、黃酮R溶液、根皮苷溶液,分別加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,37 ℃避光靜置30 min,在517 nm下用酶標儀測定其吸光值A樣品,以乙醇為空白,在517 nm下用酶標儀測定吸光值A空白[16]。按下式計算自由基清除率,且以清除率為縱坐標,溶液濃度為橫坐標繪圖,維生素C作為陽性對照,實驗重復三次,取平均值和SD值:

1.2.7.2 清除ABTS自由基活性的測定 分別檢測10、15、20、25、30、35、40 mg/mL濃度的野金柴黃酮提取液、黃酮R溶液、純化根皮苷溶液對ABTS溶液的自由基清除率。用去離子水配制7 mmol/L的ABTS溶液及2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液。取過硫酸鉀溶液5.00 mL,加入到15.00 mL ABTS溶液中,在室溫下置于黑暗處反應16 h,形成ABTS自由基儲備液。用體積分數80%乙醇對ABTS自由基儲備液進行稀釋,使其在734 nm下的吸光度為0.70±0.05,即為ABTS稀釋液,備用。取200 μL ABTS稀釋液與20 μL樣品振蕩混勻6 min,在734 nm下測定其吸光度A樣品。取200 μL ABTS稀釋液與20 μL溶劑振蕩混勻6 min,在734 nm下測定其吸光度A空白作為空白對照[17]。按公式計算自由基清除率,以清除率為縱坐標,溶液濃度為橫坐標繪圖,為能多角度地反映總黃酮、黃酮R、根皮苷的抗氧化能力,采用Trolox作為陽性對照,實驗重復三次,取平均值和SD值:

1.3 數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值,通過運用Excel、OriginPro 9.0數據處理軟件和Design-Expert.8.05、SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 野金柴總黃酮提取得率隨乙醇濃度的變化如圖1所示。由圖1可知,隨著乙醇濃度的增加,野金柴總黃酮提取得率呈現出增加的趨勢。當乙醇溶液濃度達到80%后,提取得率的提升幅度明顯放緩,基本與乙醇濃度在80%處持平。這可能是由于當乙醇濃度較低時,水分子數量較大,細胞發生溶脹導致離子通道受阻[18],黃酮無法順利從細胞被分離,而當乙醇濃度達到80%時,黃酮極性與提取液的極性相似,得率最大。因此,選擇70%～90%的乙醇濃度作為野金柴總黃酮的最佳提取濃度范圍。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

2.1.2 液料比對總黃酮得率的影響 野金柴總黃酮提取得率隨液料比的變化如圖2所示。由圖2可知,當液料比從10∶1增加到30∶1時,野金柴總黃酮的提取得率呈現出較為明顯的增長速度,其原因可能是隨著液料比的增長,野金柴細胞溶脹性提高,野金柴細胞與溶劑的接觸面積增大[19]。當液料比由30∶1增長到40∶1時,增加趨勢基本消失,液料比從40∶1增加到50∶1時,總黃酮提取得率出現下降,這可能是因為溶劑量過多時,一些其他化合物也被提取出來,使得率呈下降趨勢[20]。雖然總黃酮提取得率在液料比40∶1時最大,但由于液料比從30∶1增加到40∶1,需要消耗更多的溶劑,且提取得率的增幅并不明顯。綜合考慮,選擇30∶1～50∶1的液料比范圍作為野金柴總黃酮提取的最佳液料比范圍。

圖2 液料比對總黃酮得率的影響

2.1.3 超聲功率對總黃酮得率的影響 野金柴總黃酮提取得率隨超聲功率的變化如圖3所示。由圖3可知,當功率由300 W遞增到500 W時,總黃酮得率呈現出逐步上升的趨勢,但當功率由500 W增加到700 W時,總黃酮得率下降。這可能是由于當超聲功率在300～500 W范圍內時,空化泡的形成隨功率的升高而變得更容易,并且空化泡的崩解也隨功率的升高而變得更加劇烈;當功率超過500 W后,空化泡增長得過大,以至于不能崩解或者很脆弱的崩解,大大降低了空化作用的效果,并且過多的空化泡也會阻礙超聲波的傳播[21]。且隨著功率的增加,溶液溫度可能升高,從而導致黃酮活性發生改變。因此,當其他條件相同時,選擇400～600 W的功率范圍作為最佳提取功率范圍。

表2 Box-Benhnken實驗設計和結果

圖3 超聲功率對總黃酮得率的影響

2.1.4 超聲時間對總黃酮得率的影響 野金柴總黃酮提取得率隨超聲時間的變化如圖4所示。由圖4可知,隨著超聲時間的增加,野金柴總黃酮提取得率呈現出增長的趨勢,當超聲時間到達50 min后,提取得率提升不明顯,與超聲時間為50 min時差別不大。可能是在超聲時間增大的過程中,超聲波空化泡作用與空化泡崩解產生的機械作用有利于乙醇溶液進入組織內,加快了黃酮的溶出[22],當時間達到50 min后,組織內大部分黃酮被提取完全,剩余部分極少,增大超聲時間也難以提升黃酮得率。且若再增大超聲時間,探頭的溫度會隨之增加,導致提取劑的蒸發流失[23-24],可能導致黃酮得率反而下降。因此,在確定其他條件一致時,可選擇超聲時間40～60 min作為野金柴總黃酮的最佳超聲時間范圍。

圖4 超聲時間對總黃酮得率的影響

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面方案設計 選取(A)液料比、(B)乙醇濃度、(C)超聲功率、(D)超聲時間四個因素,設計三個水平實驗,野金柴黃酮得率為響應值。實驗設計與結果如表2所示。

2.2.2 方差分析及顯著性檢測 用軟件Design-Expert.8.05對以上數據進行回歸分析,結果如表3所示。對各因素回歸擬合,可得如下野金柴黃酮得率F(%)的回歸方程:

F=+8.81+0.011A+0.11B+0.077C+0.24D-0.078A2-0.089B2-0.23C2-0.23D2+0.013AB+0.038AC+0.018AD+0.0025BC-0.01BD+0.013CD

圖5 液料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲功率(C)、超聲時間(D)對總黃酮得率的影響

表3 回歸模型的方差分析

2.2.3 最優工藝條件的確定及模型驗證 通過Design-Expert軟件對回歸方程進行計算,得到超聲波輔助提取野金柴黃酮最佳工藝條件,在液料比41.93∶1,乙醇濃度82.55%,超聲功率539.46 W,超聲時間56.49 min的條件下,得到最高的黃酮得率為8.90%。考慮到實際條件的可操作性,將最佳工藝條件調整為:液料比40∶1,乙醇濃度80%,超聲功率540 W,超聲時間60 min。為驗證結果的可靠性,采用上述優化出的工藝參數進行3次重復實驗,得到野金柴黃酮的實際得率為8.82%±0.09%。同時,有文獻報道,自然存放1個月的多穗柯粗粉總黃酮含量為8.34%,且隨著存放時間延長,總黃酮含量不斷降低,自然存放3個月后,總黃酮含量降為7.46%[25]。實驗所使用的材料野金柴是多穗柯干制葉,參考該結論,與新鮮多穗柯嫩葉相比,存放時間更長的野金柴總黃酮含量更低,本研究優化工藝后,所得的野金柴總黃酮得率較高,說明所得回歸方程對野金柴黃酮得率進行分析和預測非常可靠,具有一定的實踐指導意義。

2.3 野金柴黃酮抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定 圖6顯示了不同濃度總黃酮、根皮苷、黃酮R對DPPH自由基的清除率。在一定范圍內,野金柴總黃酮、根皮苷、黃酮R對DPPH自由基的清除能力都隨濃度的增加而遞增,當濃度增加至0.035～0.040 mg/mL時增加趨勢放緩。且三者與VC對DPPH自由基的清除能力排序是VC>總黃酮>根皮苷>黃酮R,VC、總黃酮、根皮苷、黃酮R的IC50值分別為0.0190、0.0205、0.0222、0.0261 mg/mL。雖然黃酮R對DPPH自由基的清除能力比總黃酮和根皮苷要稍弱,但從數值上來看,黃酮R依舊有較強的DPPH自由基清除能力。

圖6 不同濃度總黃酮、根皮苷、黃酮R對DPPH及ABTS自由基清除率

2.3.2 ABTS自由基清除能力測定 圖6顯示了Trolox、總黃酮、根皮苷、黃酮R對ABTS自由基的清除效果。一定濃度范圍內,Trolox和總黃酮、根皮苷、黃酮R的ABTS自由基清除能力隨濃度的增加而增大,呈現一定的量效依賴關系,Trolox、總黃酮、根皮苷、黃酮R的IC50值分別為0.0201、0.0220、0.0233、0.0266 mg/mL。在相同濃度下,Trolox的自由基清除能力最強,黃酮R最弱,原因可能是野金柴總黃酮中的主要成分是根皮苷,黃酮R中含有槲皮苷等具有抗氧化能力的黃酮,但含量相對較少,因此抗氧化能力較低,但仍有較好的ABTS自由基清除能力。

3 結論

本實驗使用超聲波輔助提取野金柴總黃酮,并對提取工藝進行優化。通過響應面法構建了超聲波輔助提取野金柴總黃酮的數學模型,獲得了最佳提取工藝。采用ADS-7型大孔樹脂對野金柴黃酮中的根皮苷進行初步分離,并對總黃酮、根皮苷和黃酮R的抗氧化活性進行對比研究。結果表明:各提取條件對野金柴總黃酮得率的影響大小關系為:超聲時間>乙醇濃度>超聲功率>液料比。優化所得最佳提取工藝條件為液料比40∶1,乙醇濃度80%,超聲功率540 W,超聲時間60 min,此條件下野金柴總黃酮得率為8.82%±0.09%。通過大孔樹脂分離所得根皮苷,黃酮R對DPPH自由基和ABTS自由基也有較好的清除效果,是天然的抗氧化資源。目前關于野金柴黃酮的研究大都局限于總黃酮與根皮苷,尚未發現關于野金柴中黃酮R的研究,且對于野金柴的實際工業應用多為提取根皮苷,忽略了對黃酮R進行進一步的生產利用。本實驗通過研究野金柴總黃酮、根皮苷與黃酮R的抗氧化能力,證明黃酮R具有優良的抗氧化效果,說明提取完根皮苷的野金柴殘渣也可以加以利用,在實際生產中有其較高的利用價值。