肉源乳酸菌抑菌特性分析

張開屏,馬牧然,曹凱慧,馬俊杰,田建軍,*

(1.內蒙古商貿職業學院食品工程系,內蒙古呼和浩特 010070;2.內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

目前全球食品安全主要是由微生物危害及化學危害引起的食源性疾病,這在世界范圍內造成了嚴重的經濟及社會影響[1-2],因此減輕食源性疾病對人類健康及社會影響已成為一個十分重要的問題。食源性致病菌主要包括細菌、霉菌、病毒等,通過攝食進入人體后會引起相關食源性疾病。常見的食源性致病菌有:大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)等[3]。其中金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在,是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性(G+)菌[4],可分泌20 多種毒性蛋白質,其中由腸毒素A造成的食物中毒需要量僅為100 ng[5]。2015年,由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件在全球已居第4位[6]。從2005年起,金黃色葡萄球菌在美國已導致94000多起嚴重感染事件及18000多起致死事件[7]。大腸桿菌也稱大腸埃希氏菌,屬革蘭氏陰性(G-)菌,通常對人體無害,是衡量食品是否受糞源性污染的重要指標。而大腸桿菌屬中存在一些血清型特殊的菌種,它們對人體是有害的,人體攝入被該類細菌污染的食品即可發生感染,嚴重的甚至會造成死亡[8-9]。

到目前為止,已報道的250多種食源性疾病中與細菌相關的暴發性食物中毒事件約占三分之二[10],由此可見降低由食源性致病菌引起的健康疾病問題是提高食品安全性的重要方面。近些年的研究表明,除了如亞硝酸鹽、山梨酸、苯甲酸這些眾所周知的由于使用不當會對人體造成傷害的防腐劑外,一些原本被認為安全的合成防腐劑也可能具有致癌風險[11]。因此探尋具有可抑制致病菌且不會對人體健康造成傷害的新抑菌劑就變得非常有意義。益生菌是指當攝入一定量時對宿主能產生有益效果且能夠繁殖的微生物菌體[12]。多數乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是在世界范圍內被公認為“generally recognized as safe(GRAS)”等級的食品微生物[13]。具有益生作用的乳酸菌進入人體,可通過與腸道菌群相互作用,影響腸道微生物的代謝活動和生理功能,如肥胖、高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化疾病等的發生可能與腸道菌群失衡存在某些關系[14-15]。此外乳酸菌還因其具有抗氧化[16]、降膽固醇[17]、增強免疫力[18-19]等作用而被廣為人知。而乳酸菌的另一個關鍵屬性就是其本身可分泌產生多種抑菌物質,從而展示出不同程度的抗菌活性[20]。因此本研究從肉制品中分離得到的肉源乳酸菌中篩選具有抑菌活性的乳酸菌菌株,并研究其抑菌特性,對降低由食源性致病菌導致的肉制品安全問題具有重大指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

指示菌:大腸桿菌ATCC25922(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌B-250(Staphylococcusaureus)標準菌株 內蒙古農業大學食品科學與工程學院微生物實驗室提供,19株肉源乳酸菌由內蒙古農業大學肉品科學團隊從牧區風干肉制品中分離獲得,鑒定結果見表1;脫脂乳培養基(蒸餾水100 mL、脫脂乳粉10 g、酵母提取粉0.1 g,110 ℃,10 min滅菌)、水瓊脂培養基(瓊脂粉15 g/L,121 ℃,15 min滅菌)、營養瓊脂培養基(相應乳酸菌培養基或指示菌培養基與瓊脂粉混合,瓊脂粉15 g/L,121 ℃,15 min滅菌) 實驗室自配;TPY培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶(分析純、酶活力>30 U/mg) 北京Coolaber科技有限公司;乳酸標準品、乙酸標準品、丙酸標準品 色譜純,德國Dr Ehrenstorfer公司;胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、L-半胱氨酸 廣東環凱微生物技術有限公司;氯化鈉、氯化鎂、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵 國藥集團化學試劑有限公司。

表1 試驗菌株

KG-SX-500全自動高壓滅菌鍋 KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC;T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;Eppendorf低溫離心機 艾本德中國有限公司;JM-A3002電子天平 諸市超澤衡器設備有限公司;ZHJH-C1112B超凈臺、ZHJH-A2234A生物安全柜 南京博爾迪生物技術有限公司;HH-4恒溫水浴鍋 上海福瑪實驗設備有限公司;LRH恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌上清液的制備 將保存狀態的乳酸菌接種到脫脂乳培養基中進行一代活化(37 ℃,24 h),然后將一代菌接種到TPY液體培養基中進行二、三代活化(接種量2%,37 ℃,24 h),最終將三代活化菌的發酵液離心(4000 r/min,5 min)取上清,即得乳酸菌發酵上清液[21]。

1.2.2 指示菌菌懸液的制備 將未活化的金黃色葡萄球菌及大腸桿菌分別接種于LB液體培養基中,活化三代(接種量2%,37 ℃,24 h),將活化好的菌液調至濃度為107CFU/mL的菌懸液備用[21]。

1.2.3 菌落計數 將活化好的乳酸菌及指示菌用0.85%的生理鹽水分別進行10倍梯度稀釋,選取合適梯度的稀釋菌液1 mL與營養瓊脂培養基混合,37 ℃培養48 h后進行計數[21]。

1.2.4 乳酸菌上清液抑菌效果測定 采用牛津杯雙層瓊脂擴散法檢測19株乳酸菌上清液的抑菌特性。將滅菌的水瓊脂傾注于培養皿底層,待其干后在其上放置牛津杯,每個培養皿放置6個。取含107CFU/mL的指示菌100 μL與營養瓊脂培養基混合傾注于放置好牛津杯的培養皿內,待其干后拔下牛津杯,向孔內分別打入19株乳酸菌上清液(上清液均取自含有108CFU/mL的乳酸菌發酵液),每孔200 μL,將培養皿放入恒溫培養箱,經37 ℃培養24 h后取出觀察結果,用游標卡尺測量抑菌圈直徑[21]。

1.2.5 乳酸菌耐鹽、耐亞硝酸鹽及耐酸特性研究 將活化好的19株二代乳酸菌分別接種至含6% NaCl的TPY液體培養基、調酸堿度(1.0 mol/L的HCl調)使pH=5的TPY液體培養基及含亞硝酸鹽(亞硝酸鈉100 mg/kg)的TPY液體培養基內,同時以未進行上述處理的乳酸菌為對照,37 ℃培養24 h后在波長為600 nm條件下測其吸光值[22]。

1.2.6 乳酸菌上清液抑菌的物質基礎研究

1.2.6.1 酸敏感性測定 取經篩選的乳酸菌上清液5 mL,用1.0 mol/L的HCl、NaOH調其pH至5.0,以未進行pH調節的上清液為對照,根據方法1.2.4對其抑菌效果進行檢測[21]。

1.2.6.2 蛋白酶敏感性測定 參考文獻[22],取經篩選的乳酸菌上清液5 mL,用1.0 mol/L的HCl、NaOH分別調其pH為蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶的最適pH(最適pH分別為7.4、2.0、7.4),并按最終濃度為1.0 mg/mL的量分別加入上述各酶,放入37 ℃的水浴鍋中保溫2 h,再用1.0 mol/L的HCl、NaOH調回其初始pH,以未進行蛋白酶處理的上清液為對照,根據方法1.2.4對其抑菌效果進行檢測。

1.2.6.3 過氧化氫酶敏感性測定 取經篩選的乳酸菌上清液5 mL,用1.0 mol/L的HCl、NaOH將其pH調至過氧化氫酶的最適pH(pH為7)并按最終濃度為1.0 mg/mL的量加入,置于37 ℃的水浴鍋中保溫2 h,再用1.0 mol/L的HCl、NaOH調回其初始pH,以未進行過氧化氫酶處理的上清液為對照,根據方法1.2.4對其抑菌效果進行檢測[22]。

1.2.7 乳酸菌上清液抑菌效果的影響因素研究

1.2.7.1 pH對乳酸菌上清液抑菌效果的影響 將經篩選乳酸菌的上清液分pH對抑菌效果的影響,分別用1.0 mol/L的HCl、NaOH調節經篩選的乳酸菌上清液pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,以未調pH的上清液為對照,按方法1.2.4檢測其抑菌效果[22]。

1.2.7.2 溫度對乳酸菌上清液抑菌效果的影響 熱處理對抑菌效果的影響,分別在60、80、100 ℃的溫度下加熱30 min,在121 ℃下滅菌處理15 min,以未進行加熱處理的上清液為對照,按方法1.2.4檢測其抑菌效果[22]。

1.3 數據處理

使用數據處理軟件IBM SPSS Statistics 25進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌上清液抑菌效果測定結果

用牛津杯雙層瓊脂擴散法檢測19株乳酸菌上清液對指示菌的抑制效果,結果如表2所示。

表2 乳酸菌發酵上清液抑菌效果

由表2可知,19株乳酸菌對大腸桿菌的平均抑菌圈直徑為(12.25±1.78) mm,19株乳酸菌對金黃色葡萄菌的平均抑菌圈直徑為(12.21±1.18) mm,不同乳酸菌對同種指示菌的抑菌效果不盡相同;而同種乳酸菌對不同指示菌的抑菌效果也不同,以上結果說明乳酸菌上清液的抑菌效果具有特異性。根據19株乳酸菌上清液抑菌圈直徑間的顯著差異性,分別選取對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制效果高、中、低的F19、F3、F18和F16、F13、F11為后續試驗所用菌種。

2.2 乳酸菌耐鹽、耐亞硝酸鹽及耐酸特性分析

對已篩選出的F19、F3、F18、F16、F13、F11乳酸菌的耐鹽、耐亞硝酸鹽及耐酸特性進行分析,分析結果如表3所示。

表3 所篩選6株乳酸菌耐鹽、耐亞硝酸鹽及耐酸特性分析

由表3可知,實驗菌株表現為對100 mg/kg的亞硝酸鹽耐受性較好,對pH=5.0的酸性環境耐受性次之,對6% NaCl耐受性較差。

抑制大腸桿菌的F19、F3、F18乳酸菌在含亞硝酸鹽(100 mg/kg)環境中培養24 h 后OD600值均顯著高于平均水平(P<0.05);在含6% NaCl環境中培養24 h后F3、F18 的OD600值均顯著高于平均水平(P<0.05),F19略低于平均水平;在pH=5條件下培養24 h后F19、F3、F18的OD600值均顯著高于平均水平(P<0.05)。抑制金黃色葡萄球菌的F16、F13、F11乳酸菌在含亞硝酸鹽(100 mg/kg)環境中培養24 h 后OD600值均顯著高于平均水平(P<0.05);在含6% NaCl環境中培養24 h后F13、F11的OD600值均顯著高于平均水平(P<0.05);在pH=5條件下培養24 h后F16的OD600值顯著高于平均水平(P<0.05),F11與平均水平無顯著差異(P>0.05),F13略低于平均水平。由以上分析可知,本試驗所選6株乳酸菌在耐亞硝酸鹽(100 mg/kg)、耐鹽(6% NaCl)、耐酸(pH=5)特性方面表現良好,可供在發酵香腸生產中使用。

2.3 乳酸菌上清液抑菌物質的分析

2.3.1 上清液對大腸桿菌抑菌物質的分析 如圖1所示,F19、F3、F18上清液中加入過氧化氫酶后抑菌圈直徑也有顯著下降(P<0.05);經蛋白酶處理后抑菌圈直徑也有顯著下降(P<0.05),說明F19、F3、F18乳酸菌上清液中存在過氧化氫和細菌素并起到抑菌作用。F19、F3、F18上清液與對照組相比,經調節pH至5.0的上清液進行抑菌試驗時未出現明顯抑菌圈,經調節pH后的抑菌圈與對照組(15.07±0.55 mm)差異性最大,說明酸性環境是實驗乳酸菌上清液中抑菌的主要原因。

圖1 抑制大腸桿菌乳酸菌發酵上清液抑菌物質分析

2.3.2 上清液對金黃色葡萄球菌抑菌物質的分析 如圖2所示,F16、F13清液經過氧化氫酶處理后的抑菌圈直徑也有顯著下降(P<0.05);加入蛋白酶后抑菌圈直徑也有顯著下降,說明F16、F13、F11乳酸菌上清液中存在過氧化氫和細菌素并起到抑菌作用。F11上清液經蛋白酶K和胃蛋白酶處理后抑菌圈直徑較對照組顯著下降(P<0.05),經胰蛋白酶、過氧化氫處理后抑菌圈直徑與對照組無顯著差異(P>0.05)。F16、F13、F11上清液排除酸的影響后未出現明顯抑菌圈,統計分析表明經調節pH至5.0后的抑菌圈與對照組差別最大(P<0.05),說明酸性環境是上述3株乳酸菌上清液中發揮抑菌活性的主要原因。

圖2 抑制金黃色葡萄球菌乳酸菌上清液抑菌物質分析

2.4 乳酸菌上清液抑菌效果的影響因素分析

2.4.1 pH對抑菌效果的影響 pH對抑制大腸桿菌和抑制金黃色葡萄球菌的影響分別見表4和表5。

表4 pH對抑制大腸桿菌的影響

表5 pH對抑制金黃色葡萄球菌的影響

不同乳酸菌上清液在相同pH條件下抑菌能力不同,表4中pH為2.0時抑菌能力表現為F18>F19>F3,且相互存在顯著差異(P<0.05),pH為3.0時F19與F3間無顯著差異(P>0.05),與F18差異顯著(P<0.05),pH為4.0時僅F19上清液有抑菌活性,而未進行pH處理的對照組抑菌能力表現為F19>F3>F18,且相互間顯著差異(P<0.05)。由以上結果可知,在特定pH條件下不同乳酸菌具有的抑菌能力是不同的,且隨著pH的升高,抑菌能力會下降,這也從一個方面反映出pH對乳酸菌上清液的抑菌效果存在很大影響。

由測定結果可知，與對照組即未進行pH調節的上清液相比,pH為2.0時抑菌效果最強,且顯著優于對照組(P<0.05),pH為4.0時F3、F18、F11上清液已無抑菌活性,F19、F16、F13上清液雖具有抑菌活性,但其抑菌能時力也顯著低于對照組(P<0.05)。繼續升高pH分別至5.0、6.0、7.0時全部乳酸菌上清液均不顯示抑菌能力。在特定pH條件下不同乳酸菌具有的抑菌能力是不同的,且隨著pH的升高,抑菌能力會下降。

產生這種結果的原因可能是由于在低pH條件下,有機酸處于未解離狀態,對有害菌的抑制能力較強。此外有研究報道,乳酸菌代謝產物中一些非蛋白類物質在低pH環境中活性增強,會共同抑制病原菌。另外不同致病菌對酸的耐受程度不同,往往在越低的pH環境中它們越難生存。故乳酸菌上清液在越低的pH條件下顯示出越高的抑菌能力。

2.4.2 熱處理對抑菌效果的影響 乳酸菌上清液在不同溫度下處理一定時間,分析熱處理對菌液抑菌能力的影響,結果如圖3所示。

圖3 熱處理對抑制指示菌的影響

F18上清液在熱處理后其抑菌圈直徑與對照組相比無顯著差異(P>0.05);F11上清液分別在60、80 ℃處理30 min后與對照組相比抑菌圈直徑均未出現顯著下降(P>0.05),說明F18、F11上清液的抑菌物質熱穩定性較好。F19、F3、F16、F13乳酸菌上清液在不同溫度下熱處理后,其抑菌圈直徑較對照組均有顯著下降(P<0.05),且減小趨勢基本為處理溫度越高,抑菌圈直徑越小。其中F16上清液經60 ℃處理30 min后的抑菌圈直徑為(13.33±0.46) mm,經80 ℃處理30 min后為(11.83±0.74) mm,經100 ℃處理30 min后為(11.23±0.32) mm,經121 ℃處理15 min后為(10.20±0.44) mm,除80、100 ℃無顯著性差異外，以上抑菌圈直徑間均有不同程度的顯著性差異(P<0.05),且與對照組(14.47±0.38 mm)相比均有顯著下降(P<0.05),說明不同溫度熱處理一段時間會對抑菌效果產生一定影響,且處理溫度越高,影響越明顯。

產生上述結果的原因是其中的抑菌物質可能因為熱處理而發生性質改變,但用本試驗方法處理的乳酸菌上清液因有機酸發生化學變化或物理損失而造成抑菌圈直徑下降的可能性很小,因為大部分乳桿菌都產生L-乳酸[23](本試驗所用乳酸菌經鑒定大部分為乳桿菌),而L-乳酸較穩定,在本方法處理條件下,其發生變化或損失的可能性很小。

結合2.3對抑菌物質的分析,發現上清液中普遍存在過氧化氫與細菌素,可能為上清液中的過氧化氫因受熱而發生分解導致抑菌效果下降,或細菌素發生改變,因為細菌素是一種不耐熱的蛋白質細菌素,故可能是上清液中該類細菌素受熱后失活而致抑菌效果下降。

3 討論和結論

肉源乳酸菌抑菌的主要原因為上清液中的酸性環境,或抑菌物質在酸性條件下才能發揮抑菌活性,也考慮為酸的存在大大降低環境pH導致致病菌無法生存。經蛋白酶處理的肉源乳酸菌F13、F16上清液的抑菌效果均有顯著下降(P<0.05),而細菌素(Bacteriocin)是指細菌在正常生理代謝過程通過核糖體合成的一類能夠發揮抗菌活性的多肽或蛋白質復合物,它們對蛋白酶敏感,說明所選乳酸菌上清液中存在細菌素,并在抑菌中發揮了抑菌活性。經過氧化氫酶處理的肉源乳酸菌F13、F16上清液的抑菌效果均有顯著下降(P<0.05),說明所選肉源乳酸菌F13、F16上清液中存在過氧化氫,并在抑菌中發揮了抑菌活性。

19株從牧區風干肉制品中分離得到的肉源乳酸菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑分別為(12.25±1.78) mm和(12.21±1.18) mm,其中菌株F19對大腸桿菌的抑菌活性最強,抑菌圈直徑為(15.07±0.55) mm,而F11上清液對大腸桿菌完全沒有抑制效果,菌株F16對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強,抑菌圈直徑為(14.47±0.38) mm,而F6、F2上清液對金黃色葡萄球菌完全沒有抑制效果。

對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力有顯著差異(P<0.05)的乳酸菌F19、F3、F18及F16、F13、F11上清液的抑菌物質基礎是酸性環境在其抑菌過程中占主導地位,細菌素與過氧化氫發揮協同作用。不同溫度熱對上清液處理一定時間與調節上清液pH都會影響上清液的抑菌效果,且隨熱處理溫度提高,抑菌效果呈下降趨勢;pH越低,越利于發揮抑菌效果。

綜上所述,本試驗所用乳酸菌上清液中發揮抑菌主導作用的是有機酸,細菌素與過氧化氫發揮協同作用,這與Taheri等[24]在對142株乳酸菌上清液進行抑菌試驗后得出的結果類似,與熊駿等[25]從豆豉中分離出的YM-4-3乳桿菌抑菌結果也具有相似性。說明從牧區風干肉制品中分離得到的肉源乳酸菌在抑菌效果和抑菌機理方面與從其它產品中分離得到的乳酸菌研究結果相輔相成。