清流雪薯組培復壯技術

李麗紅　華樹妹　陳芝華　李清　張楊文　鄧才生

摘要：以清流雪薯有節莖段為外植體，通過對誘導、增殖、生根及移栽影響因子的研究，初步建立清流雪薯的組培復壯技術體系。結果表明，初代培養中，上部莖段用70%乙醇15 s+0.1%氯化汞5 min，中下部莖段用70%乙醇30 s+0.1%氯化汞9 min消毒效果最佳;有節莖段的誘導培養以MS+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+4.5 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭效果最佳，萌芽率達88.0%;增殖最適培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+2.0 mg/L AD+30.0 g/L蔗糖+4.5 g/L瓊脂，增殖系數為3.03;最適生根培養基為1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+20.0 g/L蔗糖+4.5 g/L瓊脂+0.5 g/L活性炭，生根率達97%;煉苗后，移入進口泥炭 ∶珍珠巖=2 ∶1 的基質中，成活率達100%。

關鍵詞：山藥;組培;復壯;清流雪薯

中圖分類號： S632.104+.3? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0151-05

收稿日期：2019-12-11

基金項目：福建省引導性項目（編號：2017N0051、2018N02020275）。

作者簡介：李麗紅（1980—），女，河南焦作人，碩士，助理研究員，主要從事山藥種質資源遺傳育種研究。E-mail：red7603@163.com。

山藥學名薯蕷，為薯蕷科薯蕷屬一年生或多年生草質藤本植物，是我國傳統的藥食同源植物，主要食用部位為地下部肥大的肉質塊莖，具有健脾、補肺、固腎、除濕、益精補氣的功效[1]。山藥為無性繁殖植物，長期無性繁殖加上人們對留種種薯選擇或貯藏不當等原因，導致山藥出現病害加重、產量降低、品質下降、種性退化等現象。李明軍等研究認為，病毒病是造成懷山藥種性退化、產量降低的重要原因，并圍繞懷山藥脫毒快繁開展了許多研究工作[2]。福建地區山藥病毒病較少，品種退化主要表現為產量降低，山藥薯皮黑斑逐年增多，尤其在當地山藥主產區問題尤為突出，嚴重的病害黑斑可深入薯肉0.5～1.0 cm，能極大地影響山藥的商品性，農民只能將山藥削皮出售，這不僅增加了勞動成本，降低了收益，同時也限制了山藥的對外銷售，對當地山藥產業發展造成嚴重影響。

清流雪薯是福建省清流縣首個獲農業農村部評審認證的國家級地理標志產品，該山藥品種具有個體較粗大、渾圓、均勻，薯體堅實，切口少黏液，不易褐變，耐貯藏等優點，而且薯質粉性足、細膩、雪白、味鮮，深受人們的喜愛，但近年來該品種退化現象嚴重，亟需解決。目前，山藥生產上主要采用零余子繁殖的方式進行品種復壯，清流雪薯為褐苞薯蕷類型，在福建地區并不結實零余子，無法通過零余子進行復壯。

本試驗通過組織培養技術復壯該品種，使其優良品種種性得以保存延續。褐苞薯蕷類型山藥，組培快繁較其他類型的山藥品種更難，筆者所在課題組從2011年開始一直致力于褐苞薯蕷類型山藥的組培復壯技術研究，現已在組培、移栽等多方面取得較大進展，并在生產上取得一定的應用成效，現就清流雪薯的組培復壯技術進行報道，為該品種的復壯及組培苗工廠化生產提供理論依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料由福建省三明市農業科學院提供，2018年3月中下旬，種植健康無病蟲危害的清流雪薯，切段種植于三明市農業科學院大棚內，待到山藥藤蔓生長旺盛期，剪取上部約30 cm藤蔓作為外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒與誘導培養基篩選

將藤蔓用剪刀去掉葉片，將其分為上部（頂端5～8 cm）和中下部2個部分，并剪成長度為1.5 cm左右帶節間的莖段，分別放在不同的容器中，置于超凈工作臺上。首先對莖段進行表面殺菌，分別倒入70%乙醇輕輕晃動15、30 s，用無菌水沖洗2～3次，然后用0.1% HgCl2消毒劑進行深層滅菌，兩者設置不同的時間處理（3、5、6、7 min和7、8、10、12 min），期間不斷搖動，最后用無菌水沖洗5～6次。將消毒處理后的有節莖段接種于MS+KT（激動素，0.5、1.0、1.5 mg/L）+0.1 mg/L NAA（萘乙酸）和MS+6-BA（細胞分裂素，0.5、1.0、1.5 mg/L）+0.1 mg/L NAA誘導培養基上。每瓶接種1個莖段，每個處理接種20瓶，重復2次，之后每周統計1次污染率。一般10 d后，在莖段葉腋處出現萌芽，30 d 統計萌芽率。

1.2.2 培養基配方

誘導和增殖培養均以MS為基本培養基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉4.5 g/L以及不同類型和濃度的激素組合（表2、表3），誘導培養基添加0.3 g/L活性炭，pH值調至6.0，增殖培養基不添加活性炭。生根培養基則以1/2MS為基本培養基，添加蔗糖20 g/L、瓊脂粉4.5 g/L、活性炭0.5 g/L 以及不同濃度的生長素（表4），pH值調至5.8。配制分裝后于121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2.3 培養條件

培養溫度為（25±2） ℃，光照度1 500 lx，每日光照14 h。

1.3 數據處理

采用Excel 2010和DPS軟件中的LSD方法進行數據處理和方差分析，各指標計算公式：污染率=污染苗數/接種苗數×100%;腋芽誘導率=腋芽萌發數/接種外植體總數×100%;增殖系數=切出有效芽總數/接種芽數×100%;生根率=生根苗數/接種苗數×100%。

2 結果與分析

2.1 消毒時間對外植體消毒效果的影響

由表1中數據可以看出，隨著氯化汞消毒時間的延長，無論上部還是中下部的莖段污染率均呈下降趨勢。上部莖段在70%乙醇15 s+0.1%氯化汞5 min與70%乙醇15 s+0.1%氯化汞4 min 2個處理間污染率差異達極顯著水平，70%乙醇15 s+0.1%氯化汞5 min與70%乙醇15 s+0.1%氯化汞6 min、70%乙醇15 s+0.1%氯化汞7 min處理之間污染率差異未達到顯著水平，但消毒處理70%乙醇15S+0.1%氯化汞5 min萌芽率最高，與其他幾個處理之間差異顯著，尤其當上部莖段消毒處理時間為7 min時，莖段褐化加重，萌芽率與處理時間為5、6 min相比極顯著降低，故上部莖段最適宜的消毒時間為70%乙醇15 s+0.1%氯化汞5 min。中下部莖段不同消毒時間處理之間污染率差異均達到顯著水平，說明隨著消毒時間的延長，污染率呈顯著下降趨勢，但萌芽率以70%乙醇30 s+0.1%氯化汞9 min消毒處理時最高，并與其他幾個處理差異達顯著水平，故中下部莖段最佳消毒時間為70%乙醇30 s+0.1%氯化汞9 min?？傮w看，上部莖段較中下部莖段更容易消毒，污染率低，但萌芽率也低;中下部莖段污染率高于上部莖段，但萌芽率高，這可能是中下部莖段較粗壯，芽體發育更成熟的原因。

2.2 不同濃度KT、6-BA和NAA組合對山藥芽誘導的影響

將有節莖段插入不同濃度生長調節劑的初代培養基上，節基部靠近培養基，基部以上露于培養基外。一般10 d左右會在葉腋處萌出小芽，1個月后，生長好的可達3 cm，具有2～3個節，差的僅萌發出1個芽點，這種芽點有的會慢慢長大，有的則會逐漸褐化，慢慢死亡。從表2可以看出，4號、5號、6號培養基萌芽率極顯著高于1號、2號和3號培養基，也就是說KT不同水平處理極顯著優于6-BA處理。KT處理中又以5號培養基萌芽率最高，達88.0%，與4號培養基和6號培養基差異極顯著，且萌芽多為對生芽（圖1-A）。6-BA處理中1號和2號培養基萌芽率差異未達到顯著水平，分別為52.3%和51.3%。2號與3號培養基萌芽率差異達極顯著水平，說明3號培養基作為誘導培養基時效果最差。從莖段不同部位萌芽率來看，以莖蔓中下部的節段萌芽率高，莖蔓上部的莖段萌芽率低。不同培養基除萌芽率不同外，萌芽質量也存在較大差異，KT誘導萌芽早，芽較健壯，萌芽成活率高，6-BA誘導萌芽較晚，芽的質量較差，多為芽點，萌發后不再生長，成活率較低。因此，無論從萌芽率還是芽的長勢看，均1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA處理最優。

2.3 不同植物生長調節劑對山藥增殖效果的影響

從表3可以看出，1 mg/L KT+0.1 mg/L NAA雖然誘導效果好，但用于增殖效果較差，主要表現為多數生根、植株生長健壯，葉色濃綠，但不增殖。將KT的濃度增加到3 mg/L，仍不增殖，而在1.0 mg/L KT中在加入少量的6-BA即開始增殖，說明山藥繼代培養時對KT不敏感，而對6-BA比較敏感。綜合分析，增殖培養基最佳組合是MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA+2 mg/L AD（腎上腺髓質的主要激素），芽多，葉色濃綠，生長健壯，成苗率高（圖1-B）。

2.4 不同植物生長調節劑對山藥生根效果的影響

由表4可知，0.5 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭與0.3 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭2個處理的生根率分別為94%和97%，兩者之間差異達顯著水平，未達到極顯著水平。而1.0 mg/LKT+0.1 mg/L NAA與其他2個處理之間差異達到極顯著水平，生根率僅為89%，說明除1.0 mg/LKT+0.1 mg/L NAA處理外，其他2個處理均可作為生根培養基使用，但0.3 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA+0.5 g/L 活性炭的培養基生根條數及側根更多、苗生長更健壯（圖1-C）。一般山藥生根培養10 d左右根系開始生長，同時植株長高，葉片長大，35 d左右即可根據根系及植株生長情況進行移栽種植。

2.5 不同栽培基質對組培苗移栽成活率的影響

移栽前2周，將瓶苗搬至溫室大棚內，放置1周，使其適應外界環境，如遇到氣溫較高時，需覆蓋遮陽網，避免組培苗被灼傷。1周后，打開瓶蓋煉苗1～2 d，再用鑷子小心把苗夾取出來，用自來水將基部的培養基沖洗干凈，并用多菌靈800倍液浸泡5 min，然后移至穴盤種植。從表5可以看出，3種基質中普通草炭土 ∶細沙=2 ∶1時成活率略低，為95%。進口泥炭土與珍珠巖（2 ∶1）和進口泥炭土與細沙（2 ∶1）配比成活率均為100%，但由于珍珠巖透氣性更好，進口泥炭土與珍珠巖（2 ∶1）配比根系須根多，效果更好 （圖1-E）。

3 結論與討論

外植體消毒是誘導栽培的關鍵步驟，消毒時間的長短不但影響污染率， 還直接關系外植體的褐化率及萌芽率。本研究中，隨著氯化汞消毒時間的延長，污染率減少，但褐化程度加重，從而影響萌芽率。中下部莖段發芽率明顯高于上部莖段，因此，清流雪薯組培最適宜選用植株中下部莖段，70%乙醇30 s+0.1%氯化汞9 min或者根據材料不同部位做適當調整，同時考慮取材時期，這樣更有利于提高萌芽率。但也有研究認為，山藥頂端10 cm幼嫩莖段表面光滑、易消毒，更適合作外植體使用[3]。

本試驗中KT誘導整體好于用6-BA誘導，清流雪薯用1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA的激素組合最適宜山藥芽體的誘導，不僅芽體誘導形成的時間短，且形成的芽體飽滿有活性，可直接長成健康植株。但KT用于增殖效果不好，表現為葉片生長，生根，植株較大，但幾乎不長新芽，增殖系數很低。本試驗中清流雪薯適宜芽體增殖的最佳培養基激素組合為0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L AD，這與前人研究結果[4-8]不同，這可能與山藥不同類型及品種有關，因此，在進行山藥組培苗生產時，應針對不同品種篩選出適宜的激素類型和濃度。本研究還發現，添加AD有利于山藥組培苗的生長，具體原因還有待進一步研究。

褐化是山藥組培過程中存在的普遍現象，也是限制一些山藥品種開展組培研究工作的重要因素。黃玉吉等研究表明，添加2.0 mg/L活性炭及100 mg/L 抗壞血酸，山藥莖段基本不褐變，出芽率高[9]。劉金英等研究表明，添加AC、VC 和 PVP等抗氧化劑，僅有AC能有效地抑制褐變，但AC對試管苗生長有較大的影響[4]。本試驗研究發現，在誘導階段添加AC有助于減輕褐化，促進萌芽和生長，但在增殖階段添加AC的組培苗則以生根和莖葉生長為主，影響增殖率，研究結果和劉金英等的報道結果有相似之處。

組培苗的移栽成活率是關系組培苗能否在生產中推廣應用的關鍵[10]，山藥組培苗移栽成活率的高低除與品種、移栽基質有關外，移栽種植的大棚環境也至關重要。本試驗初期在簡易大棚中種植，加上南方春季氣溫變化無常，移栽成活率受天氣影響較大，成活率較低。溫度低，組培苗生根慢、易霉爛;溫度高，組培苗葉片易萎蔫枯死，不但移栽成活率低，且成活的苗因受損嚴重，質量較差，后期需要較長時間緩苗，收獲的一級種薯產量低。通過對比試驗發現，采用進口泥炭與珍珠巖混合基質（比例為2 ∶1）在可溫控的大棚內移栽，組培苗的成活率可以大大提高，加上適宜的管理，基本可以達到95%以上。此外，組培苗收獲的一級種薯大小差異較大，大的塊莖可達200 g，和普通薯塊種植的大小差不多，小的僅有20 g左右，這種差異與組培苗質量、組培苗成活率及后期田間管理有直接關系，同時也可以看出組培苗一級種薯的產量還有很大的提升空間。經組培復壯后的種薯田間長勢優于未組培的種薯，表現為植株地上部生長勢強、分枝較多、枝葉繁茂、抗病能力增強。一級種薯第2年種植產量與對照相比，產量可提高20%左右，薯皮顏色鮮黃（圖1-F），薯肉質地更緊實。

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