基于網絡藥理學分析“陳皮-半夏”藥對治療老年肺癌的潛在作用機制

程祺 郝珍珠 樸星虎 王冰梅

(長春中醫藥大學 1臨床醫學院，吉林 長春 130117；2臨床醫學院生理教研室)

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因，其中80%是非小細胞肺癌，好發于老年人〔1,2〕。2012年，超過160萬人死于肺癌，預計到2035年，這一數字將增至300萬，繼續成為主要的健康問題〔3,4〕。老年肺癌現階段治療主要采用手術、靶向藥物治療、化療及放療等〔5，6〕。近年來，針對免疫檢查點抑制劑(ICIs)開展的免疫治療研究日益增多，為老年肺癌的治療提供了新的思路〔7〕。而中國傳統醫藥在老年肺癌治療療效的提升、放化療毒副作用的減輕及生存質量提高等多方面尤為關鍵。

“陳皮-半夏”是中醫臨床上常用的理氣化痰藥對，臨床治療上多與呼吸系統疾病相關。陳皮、半夏均性辛、溫，都歸脾、肺經，兩者配伍，相互促進，散降有序，使脾氣運而痰自化。研究表明，痰證為肺癌晚期患者的主要證候，而且近年以“陳皮-半夏”為君臣藥對治療腫瘤的研究日益增多，尤其是肺癌〔8〕。藥理研究也表明以“陳皮-半夏”為君臣的二陳湯，可逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的作用，認為其作用主要與通過Jun氨基末端激酶(JNK)信號轉導通路而使多藥耐藥相關蛋白(MRP)1和P-糖蛋白(P-gp)表達下降有關〔9〕。但是，由于中草藥是通過調節多種蛋白質而不是單一靶點起作用，目前“陳皮-半夏”藥對治療肺癌上的研究還難以有效、科學、全面地闡釋其作用機制。

網絡藥理學是一種包括系統生物學、網絡分析、連接性、冗余性和多效性的藥物設計方法〔10〕，可以更科學、全面地用來評價中藥有效性的作用靶點、通路等。因此，本研究采用網絡藥理分析老年肺癌患者應用“陳皮-半夏”藥對治療的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1檢索藥對的有效成分及靶基因 從中草藥系統藥理學數據庫平臺(TCMSP)〔11〕檢索得到“陳皮-半夏”藥對的成分和靶基因。根據藥物代謝動力學(ADME)〔12〕原理的口服藥物相似性(DL)≥0.18及生物利用度(OB)篩選成分，從而能夠獲得“陳皮-半夏”藥對的有效活性成分。“陳皮-半夏”藥對的有效成分所對應的靶基因運用Perl語言進行獲取。

1.2檢索疾病的相關基因 GeneCards〔13〕基本覆蓋了幾大數據庫對于基因的分析數據，是人類基因的綜合數據庫。將“lung cancer”作為關鍵詞進行檢索，獲得老年肺癌相關的基因。將“陳皮-半夏”藥對的有效活性成分所對應的靶基因與老年肺癌相關基因進行映射，取兩數據集的交集，以此能夠獲得老年肺癌“陳皮-半夏”藥對治療的基因組合。

1.3構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡 Cytoscape是一款圖形化顯示網路并進行分析和編輯的軟件，它是研究中藥網絡藥理學常用的軟件。本研究使用Cytoscape(Version3.6.1)，導入“陳皮-半夏”藥對有效成分和老年肺癌的靶基因數據，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡。其中，節點(node)代表“陳皮-半夏”藥對、老年肺癌、藥對的有效活性成分、關鍵靶基因等；邊“edge”代表“陳皮-半夏”藥對與其活性成分、靶基因與肺癌、靶基因與活性成分等相關性。該系統網絡分析進一步推斷了“陳皮-半夏”藥對作用于老年肺癌的藥理機制。

1.4構建蛋白相互作用(PPI)網絡 String數據庫〔14〕主要是用于預測蛋白質與已知蛋白質間相互作用進行搜索的一個數據庫，而通過該數據庫能夠用于2 031個物種，其中包括1 380萬種蛋白質與960萬種蛋白間相互作用，常用來構建PPI網絡。將“陳皮-半夏”藥對治療老年肺癌的靶基因數據導入Srting數據庫，在“Home sapiens”范圍內，構建PPI網絡。在構建網絡的過程中，可對蛋白間相互作用的置信度設定閾值，本研究選擇中等置信度0.4，對PPI進行篩選。

1.5基因本體(GO)及基因組百科全書(KEGG)富集分析 R是屬于GNU系統的一個自由、免費、源代碼開放的軟件，它是一個常用于生物信息分析和可視化的優秀工具。在R軟件(Version3.6.2)中安裝Bioconductor相關軟件包，將數據轉化為基因名稱(entrezID)，定義P<0.05，Q<0.05來進行GO和KEGG的富集分析，且以氣泡圖與條形圖形式將結果給予輸出。

2 結 果

2.1“陳皮-半夏”活性成分及靶基因 通過TCMSP數據庫檢索共獲取63種陳皮成分，獲取116種半夏成分。根據DL≥0.18與OB≥30%篩選成分，其中獲得5個陳皮，13個半夏的有效活性成分，“陳皮-半夏”藥對的有效活性成分總共18種，見表1。選擇“Related Targeted”，檢索得陳皮相關靶基因479個，半夏相關靶基因1 302個，“陳皮-半夏”藥對相關靶基因共1 781個。用Perl語言獲取“陳皮-半夏”藥對有效活性成分所對應的靶基因共288個。

表1 “陳皮-半夏”藥對的有效活性成分及OB、DL

2.2老年肺癌的相關基因 按“lung cancer”為關鍵詞檢索GeneCards數據庫，檢索出21 901個肺癌相關基因，然后將其與“陳皮-半夏”藥對有效活性成分所對應的靶基因進行映射，得到“陳皮-半夏”藥對治療老年肺癌的靶基因共56個。

2.3“藥物-成分-靶點-疾病”網絡 將“陳皮-半夏”藥對的有效活性成分、成分作用的靶基因及老年肺癌相關靶基因的數據導入Cytoscape軟件，以此構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡。

2.4PPI網絡的構建 將“陳皮-半夏”藥對治療老年肺癌的靶基因輸入String，選擇中等置信度0.4，構建PPI網絡。PPI網絡顯示了靶基因編碼蛋白之間的相互作用關系。使用R語言來提取蛋白間相互作用關系最緊密的核心基因，用橫向條形圖來表示。其中排在前5的基因是血管內皮生長因子(VEGF)A、雌性激素受體(ESR)1、原癌基因(FOS)、細胞凋亡因子終末剪切酶(CASP3)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK8)。

2.5GO富集分析 通過R語言實現“陳皮-半夏”藥對核心靶基因的GO功能富集分析，其涉及77種生物學過程，并且通過P值矯正排序，而其中選擇前20采用橫條形圖表示。“陳皮-半夏”藥對主要參與轉錄因子活性、核受體功能、乙酰膽堿受體活性、類固醇激素受體活性、G蛋白耦聯胺受體活性、神經遞質受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等。

2.6KEGG富集分析 通過R語言實現“陳皮-半夏”藥對核心靶基因的KEGG功能富集分析，其治療老年肺癌涉及82條信號通路，矯正P值進行排序，選擇前20以橫條形圖表示。其涉及細胞凋亡、p53、白細胞介素(IL)-17、非小細胞肺癌、鉑類藥耐藥等信號通路，同時也包括結直腸癌、前列腺癌等其他腫瘤相關信號通路。

3 討 論

老年肺癌的病機多傾向于肺臟功能失調，氣機不利，津液失于輸布，津液聚而為痰，痰凝氣滯。所以痰濕阻肺是其主要的病理機制之一。《醫林繩墨》卷二也論述了這類病機產生的過程：“人之氣道，貴處清順，其痰不生。設若窒塞其間，痰必壅盛。或因風、寒、署、濕、熱之外感，或因七情、飲食內傷，以致氣逆液濁，而變為諸癥之所生焉。”“陳皮-半夏”是中醫臨床上常用的理氣化痰藥對，因此“陳皮-半夏”藥治療痰證型肺癌機制值得深入研究。

在本研究中，“陳皮-半夏”藥對的主要活性成分為柚皮素、川陳皮素、黃芩素、黃芩苷、β-谷甾醇、松柏素等。已有研究表明，柚皮素是通過誘導人肺癌A549細胞的死亡受體(DR)5表達〔15〕，來抑制A549細胞的增殖并誘導其凋亡〔16〕。柚皮素能誘導NcI-H2170細胞產生G1期阻滯，使得多聚ADP核糖聚合酶(PARP)蛋白表達量下降，從而抑制人肺鱗癌NcI-H2170細胞增殖。同時它還可以促使凋亡因子BH3結構域凋亡誘導蛋白(Bid)表達上調、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)表達下調，半胱天冬酶-3酶原(Procaspase-3)、Procaspase-8被激活，誘導NcI-H2170細胞凋亡〔17〕。Qin等〔18〕發現小鼠口服柚皮素可明顯減少腫瘤細胞向肺轉移的數量。而川陳皮素具有預防各種腫瘤發生發展的作用，具有抑制多種腫瘤細胞增殖作用〔19〕。黃芩苷則可以通過阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖來達到直接抗腫瘤的作用，同時其抗氧化、抗炎作用可以直接影響腫瘤細胞的增殖〔20〕。從“藥物-成分-靶點-疾病”網絡發現，β-谷甾醇作用于CASP9、CASP3、CASP8等與細胞凋亡密切相關的靶點，所以其可能對治療老年肺癌有效，值得進行深入的藥理學研究。

構建PPI網絡得到核心靶基因，其中VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、MAPK8處于核心的位置，與其余蛋白有著密切的聯系。VEGFR與腫瘤細胞的增殖、生長、遷移、分化和凋亡密切相關，進而影響肺癌的轉移和預后〔21〕。ESR2基因的多態性則與非吸煙女性肺癌的發病存在關聯〔22〕。c-FOS在非小細胞肺癌中的表達陽性率均明顯高于癌旁組織，且其表達與淋巴轉移有關〔23〕。CASP3與細胞凋亡密切相關，并且影響腫瘤的發生、發展及化療療效〔24〕。

GO功能富集集中于轉錄因子活性、核受體功能、乙酰膽堿受體活性、類固醇激素受體活性、G蛋白耦聯胺受體活性、神經遞質受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等。KEGG功能富集集中于細胞凋亡、p53、IL-17、非小細胞肺癌、鉑類藥耐藥等信號通路。p53是抑癌基因，可以通過上調p53及其下游基因的表達來促進肺癌細胞凋亡〔25〕。IL-17A/IL-17RA可通過激活非小細胞肺癌細胞中的p38 MAPK信號通路上調MMP-2、MMP-9表達，對非小細胞肺癌惡性生物學行為進行影響，而促進其進展〔26〕。所以“陳皮-半夏”藥對老年肺癌治療的作用機制可能與上述信號通路密切相關。

網絡藥理學是一種藥物設計方法，應用該方法能夠對中藥活性成分與靶基因相關性進行更加高效的獲取，但應用該方法無法確切獲得活性成分對靶基因的調控關系，仍需實驗加以驗證。

綜上所述，“陳皮-半夏”藥對和老年肺癌靶基因的主要活性成分為柚皮素、川陳皮素、黃芩素、黃芩苷、β-谷甾醇、松柏素等，其中β-谷甾醇現研究較少，值得進行深入的藥理學研究。“陳皮-半夏”藥對對老年肺癌作用的機制可能與VEGFR、ESR2、FOS、CASP3、MAPK8表達的蛋白密切相關，可能與其調節細胞凋亡、p53、IL-17、非小細胞肺癌、鉑類藥耐藥等信號通路相關。