細胞增殖上調因子促進神經膠質瘤細胞增殖的潛在機制

馮濤 楊霄鵬 李富強 劉前 白銀雪

(1南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院神經內科，河南 南陽 473058；2鄭州大學第二附屬醫院神經內科)

神經膠質瘤是一種發病率和死亡率均較高的原發性中樞神經系統腫瘤，其發生和發展的分子機制并不完全清晰，研究其發病的可能機制對防治神經膠質瘤具有重要意義。細胞增殖上調因子(URGCP)又稱為上調基因(URG)4，可通過調控胞內基因的表達參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡等生理過程，與消化系統、內分泌系統和呼吸系統等腫瘤的發生發展均密切相關〔1～3〕。然而，目前發現URGCP在神經系統腫瘤神經母細胞瘤中的研究較多，而在膠質瘤的研究較少〔4，5〕。因此，本研究通過檢測URGCP在膠質瘤細胞中的表達，構建URGCP沉默或過表達的膠質瘤細胞，觀察其對細胞增殖的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人正常星形膠質細胞株NHA購于美國ScienCell研究實驗室，神經膠質瘤細胞株A172、U251和U87購于中科院上海細胞庫。RPMI1640培養基購于美國Gibco公司，URGCP-siRNA和陰性對照序列Scrambled siRNA及pcDNA3.0-URGCP重組質粒及pcDNA3.0空載體質粒購于美國Ambion公司。總蛋白提取試劑盒和脂質體2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司，二辛可寧酸蛋白檢測試劑盒購于美國Pierce 公司。URGCP抗體(1∶1 000)購于美國Abcam公司，胰蛋白酶、胎牛血清、MTT試劑和GAPDH抗體(1∶1 000)購于美國Sigma公司，IκBα抗體(1∶500)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體(1∶500)、CyclinE1抗體(1：800)、核轉錄因子(NF)-κB/p65抗體(1∶500)和羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶2 000)均購于美國Santa cruz 公司，p-IκBα抗體(1∶1 000)購于美國Cell Signaling公司。

1.2細胞培養 以37℃水浴解凍復蘇儲存的NHA、A172、U251和U87細胞，采用含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養基，于5%CO2、37℃飽和濕度的細胞培養箱內培養。每2 d換液培養，待細胞幾乎鋪滿培養瓶底時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集第3～5代對數生長期細胞進行實驗。

1.3Western印跡檢測 收集生長良好的NHA、A172、U251和U87細胞，以總蛋白提取試劑盒提取各種細胞的總蛋白，并采用二辛可寧酸蛋白檢測試劑盒進行定量。取適量蛋白加入等體積上樣緩沖液，置于沸水浴中變性5～10 min。取變性蛋白60 μg行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。蛋白分離結束后，采用轉膜儀轉膜。將帶有蛋白樣品的聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸入封閉液(含50 g/L去脂奶粉)封閉處理1～2 h。封閉液洗膜后，加入特異性一抗4℃下孵育24 h。再以封閉液洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗于37℃下反應1 h。以二氨基聯苯胺顯影后，以GAPDH作內參，凝膠成像系統拍照分析目的蛋白的灰度值。后續實驗中對CyclinD1和CyclinE1蛋白及NF-κB信號通路相關蛋白的檢測亦采用上述方法。

1.4細胞轉染 轉染前1 d，將長勢良好的U87細胞和A172細胞以每孔106個接種至6孔板上，于細胞培養箱中常規培養24 h。根據轉染試劑脂質體2000說明書將URGCP-siRNA和Scrambled siRNA轉染至U87細胞中，分別標記為siURGCP組、Scrambled組，并以只加入脂質體2000的U87細胞作為空白1組。同樣方法將pcDNA3.0-URGCP和pcDNA3.0質粒轉染至A172細胞中，并標記為URGCP組、Vector組，同時設置只加入轉染試劑的A172細胞為空白2組。兩種細胞均在轉染6 h后，更換新鮮培養基，再于細胞培養箱內培養。48 h后，收集各組細胞，采用Western印跡檢測URGCP的表達情況。

1.5細胞增殖實驗 收集對數生長期的各組細胞，以每孔104個細胞種植到96孔板上，每組設置6個復孔。設置24、48、72和96 h 4個檢測時間點，分別培養至所需時間點后，取出培養板，每孔加入20 μl、5 g/L MTT溶液，常溫下反應4 h后，加入150 μl二甲基亞砜震蕩反應10 min，以酶標儀檢測細胞在450 nm處的吸光(OD)值，將對照組細胞的活力設為1，實驗組細胞活力=實驗組OD值/對照組OD值。根據細胞活力繪制生長曲線。

1.6克隆形成實驗 收集對數生長期的各組細胞，以每孔2 ml細胞懸液(細胞濃度為600個/ml)接種至6孔細胞板上。置于細胞培養箱中常規培養10 d。采用磷酸緩沖液洗滌后，每孔加1 ml 4%多聚甲醛固定10 min。再加入1 ml結晶紫染色10 min。洗滌晾干后，顯微鏡下觀察拍照，統計克隆數即大于50個細胞的集落個數。

1.7統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1URGCP在膠質瘤細胞中的表達 URGCP蛋白在神經膠質瘤A172、U251和U87細胞中的表達水平(0.34±0.03、1.02±0.1、1.23±0.12)依次增大，且均明顯大于正常星形膠質NHA細胞(0.15±0.02，P<0.05)。見圖1。

圖1 URGCP在膠質瘤細胞中的表達

2.2構建沉默URGCP的U87細胞和過表達URGCP的A172細胞 轉染URGCP-siRNA后，U87細胞中URGCP蛋白表達水平(0.22±0.02)較空白1組(0.83±0.08)明顯降低(P<0.05)，而轉染Scrambled siRNA后，U87細胞中URGCP蛋白表達水平(0.79±0.08)與空白組差異無統計學意義(P>0.05)；同時，在轉染pcDNA3.0-URGCP的A172細胞中URGCP蛋白表達(0.76±0.08)較空白2組(0.35±0.04)明顯升高(P<0.05)，而轉染pcDNA3.0質粒的A172細胞中URGCP蛋白表達(0.34±0.03)與空白2組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 URGCP在U87細胞和A172細胞中的表達

2.3沉默URGCP抑制U87細胞增殖 MTT檢測0、24、48、72和96 h作用時間下空白1組細胞的相對活力分別為0.20±0.02、0.42±0.05、0.65±0.07、0.89±0.09、1.21±0.13，Scrambled組分別為0.22±0.02、0.38±0.04、0.60±0.07、0.85±0.09、1.14±0.13，siURGCP組為0.21±0.02、0.32±0.03、0.39±0.04、0.44±0.04、0.47±0.05。比較24、48、72和96 h同一作用時間發現，siURGCP組細胞的相對活力較空白1組明顯降低(P<0.05)，而Scrambled組與空白1組相比未見明顯改變(P>0.05)。同時，克隆形成實驗得到，siURGCP組細胞的克隆數明顯低于空白1組(39.24±2.14 vs 113.54±6.58，P<0.05)，而Scrambled組(109.13±5.32)與空白1組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4過表達URGCP促進A172細胞增殖 MTT檢測各組A172細胞的相對活力發現，0、24、48、72和96 h作用時間下，空白2組細胞的相對活力分別為 0.21±0.02、0.27±0.03、0.35±0.04、0.46±0.05、0.55±0.06，Vector組分別為0.21±0.02、0.24±0.03、0.32±0.03、0.42±0.04、0.51±0.05，URGCP組分別為0.22±0.02、0.38±0.04、0.54±0.05、0.79±0.08、1.04±0.11。同一作用時間下(24、48、72和96 h)比較發現，在A172細胞中過表達URGCP后，與沉默URGCP抑制U87細胞增殖的結果相反，URGCP組細胞活力顯著增強(P<0.05)；同時，URGCP組細胞的克隆數明顯大于空白2組(129.60±12.54 vs 67.24±5.32，P<0.05)。與空白2組相比，Vector組細胞活力及克隆數(64.57±6.18)差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組U87、A172細胞的克隆情況

2.5沉默URGCP抑制U87細胞中CyclinD1和CyclinE1表達 空白1組與Scrambled組CyclinD1、 CyclinE1蛋白表達水平差異無統計學意義(0.97±0.10 vs 1.01±0.11，1.25±0.13 vs 1.31±0.13，P>0.05)，但siURGCP組(0.32±0.03、0.15±0.02)較空白1組均明顯降低(P<0.05)。在A172細胞中，與空白2組相比，Vector組細胞中CyclinD1、 CyclinE1蛋白表達水平差異無統計學意義(0.25±0.03 vs 0.32±0.03，0.15±0.02 vs 0.12±0.01，P>0.05)，而URGCP組(0.62±0.05、0.78±0.08)顯著高于空白2組。見圖4。

圖4 URGCP對CyclinD1和CyclinE1蛋白表達的影響

2.6沉默URGCP抑制U87細胞中NF-κB通路 在U87細胞中，空白1組、Scrambled組和siURGCP組中p-IκBα蛋白的相對表達水平分別為1.35±0.14、1.28±0.13、0.22±0.02；IκBα分別為0.97±0.11、0.92±0.09、1.01±0.10；細胞質中NF-κB/p65表達水平分別為0.32±0.03、0.37±0.04、0.81±0.08，而細胞核中NF-κB/p65表達水平分別0.87±0.09、0.91±0.09、0.33±0.03。可見，沉默URGCP表達使U87細胞中 p-IκBα和胞核NF-κB/p65表達降低(P<0.05)，而使胞質NF-κB/p65表達升高(P<0.05)。在A172細胞中。空白2組、Vector組和URGCP組細胞中p-IκBα蛋白的相對表達水平分別0.12±0.01、0.15±0.02、0.57±0.06，IκBα分別為0.31±0.03、0.28±0.03、0.32±0.03，胞質NF-κB/p65分別為0.55±0.05、0.53±0.05、0.29±0.03，胞核NF-κB/p65分別為0.52±0.05、0.61±0.06、1.06±0.11。見圖5。

圖5 URGCP對NF-κB信號通路的影響

3 討 論

URGCP是一種定位于7q13染色體可編碼922個氨基酸的腫瘤相關基因，在多種腫瘤細胞或組織中高表達，且與患者預后不良關系密切〔6,7〕。URGCP已被證實在鼻咽癌和宮頸癌組織或細胞中表達上調，與臨床分期、腫瘤大小和淋巴結轉移等有關，URGCP高表達的患者預后較差〔8,9〕。URGCP作為一種促癌基因，在腫瘤的多種生物學功能如血管生成、化療藥物耐藥、細胞增殖、轉移和凋亡等中發揮重要的調控作用〔10〕。在肝癌中，URGCP可通過激活NF-κB信號通路促進癌細胞的血管生成〔11〕；URGCP過表達增加了順鉑誘導膀胱癌細胞凋亡的能力，并促進了抗凋亡基因Bcl-2、生存素(survivin)、髓樣細胞白血病(MCL)-1和LIP的表達〔12〕；抑制URG4的表達可通過下調CyclinD1、β-catenin 及c-myc的表達抑制宮頸癌小鼠的生長〔13〕；URGCP通過NF-κB活化增強基質金屬蛋白酶(MMP)-9表達促進了非小細胞肺癌(NSCLC)細胞的侵襲、遷移和遠處轉移，而下調URGCP則抑制了這些惡性特征〔14〕。可見，URGCP基因與多種腫瘤的發生發展密切相關，干擾其表達有望成為腫瘤治療的新靶點。然而，目前URGCP與膠質瘤的研究較少，其對膠質瘤的調控機制尚不明確。因此，本研究通過體外細胞實驗初步觀察URGCPP對膠質瘤細胞增殖的影響。本研究結果提示，URGCP可能在膠質瘤的發生發展過程中發揮重要的促進作用。CyclinD1和CyclinE1均是細胞周期調控蛋白，在細胞從G1期進入到S期時發揮重要的促進作用；同時CyclinD1也是導致細胞增殖失控的原癌基因，兩者在膠質瘤細胞的增殖過程中發揮著重要的調控作用〔15,16〕。NF-κB信號通路是一種與多種腫瘤包括膠質瘤發展密切相關的轉錄調控通路〔17,18〕。當受到外界刺激時，胞質內IκBα可被磷酸化，從NF-κB/p65與IκBα形成的復合物中降解，從而激活NF-κB/p65進入細胞核，通過調控相關基因如CyclinD1和CyclinE1等參與調控細胞增殖過程〔19,20〕。已有研究〔11，21〕證實下調URGCP可誘導細胞周期阻滯，抑制NF-κB信號通路的活化。本研究通過檢測膠質瘤細胞中CyclinD1、CyclinE1、IκBα、p-IκBα和胞核內外NF-κB/p65蛋白的表達，以評價URGCP促進膠質瘤細胞惡性增殖的分子機制，研究結果提示，URGCP可能通過激活NF-κB信號通路促進了膠質瘤細胞的惡性增殖。

綜上，URGCP在神經膠質瘤細胞中表達升高，可通過激活NF-κB信號通路促進癌細胞的增殖。本研究僅從體外細胞水平上評價了URGCP對膠質瘤的促增殖作用，后續有待從體內動物實驗進一步驗證。