不同濃度七氟烷麻醉后對大鼠α4乙酰膽堿受體及認知功能的影響

曾暉 陳桂萍 林小龍 丘祿英 謝在斌 肖海榮

(福建中醫(yī)藥大學附屬龍巖人民醫(yī)院，福建 龍巖 364000)

七氟烷是一種優(yōu)良的全身麻醉劑，無色無刺激，與其他常規(guī)全身麻醉劑相對比，具有不可燃、誘導期短、蘇醒快、容易控制麻醉深度的特點，且毒副作用更小，已經(jīng)作為新型的吸入型麻醉劑廣泛運用于臨床〔1〕。全身麻醉術(shù)后患者易發(fā)生術(shù)后認知功能障礙(POCD)，表現(xiàn)為記憶力、學習力、集中力的損害，嚴重者可引發(fā)癡呆，其發(fā)生機制尚不明確，目前認為與神經(jīng)遞質(zhì)的改變相關(guān)，中樞神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的異常可導致認知功能的異常。有研究顯示，不同年齡大鼠吸入七氟烷均可引起認知功能損害〔2，3〕，具體機制尚未闡明，本研究擬從中樞神經(jīng)遞質(zhì)受體α4乙酰膽堿受體(α4-nAchR)的變化情況入手，探討七氟烷對大鼠認知功能的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1動物、試劑與儀器 4月齡SD成年大鼠120只，雌雄各半，體重300 g左右(同濟醫(yī)科大學實驗動物中心提供)；七氟烷(山東魯南貝特制藥有限公司)，Morris水迷宮試驗(成都泰盟科技有限公司提供)，自動曝光儀(美國Bio-Rad)，時實熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)

1.2實驗方法 120只大鼠隨機分為對照(con)組、1%七氟烷(S1)組、2%七氟烷(S2)組、3%七氟烷(S3)組，麻醉前均進行5 d的Morris水迷宮定位航行訓練，水迷宮為一圓形水池，分為四個象限，每個象限中點標記為大鼠入水點，第四象限上設(shè)置黑色平臺，將平臺置于水面下1 cm，每天訓練4次，將大鼠分別從四個象限入水點面向池壁放入水中，限定大鼠2 min內(nèi)找到平臺并在平臺上休息10 s，若未在規(guī)定時間內(nèi)找到平臺，則用木棒指引其找到平臺并休息10 s，記錄4次逃避潛伏期及總路程計算平均值。訓練結(jié)束后開始麻醉，將大鼠放入80 cm×50 cm×20 cm的自制密閉透明容器中，容器有兩個開口，一個連接麻醉機，另一個連接濃度監(jiān)測儀，保持容器內(nèi)麻醉藥物在指定的濃度不變。對照組吸入空氣，S1、S2、S3組分別吸入1%、2%、3%七氟烷，吸入時間均為2 h，麻醉結(jié)束后每組均分為三個亞組，即刻蘇醒組(麻醉后2 h)、麻醉后24 h組及麻醉后72 h組，每個亞組各10只。

1.3觀察指標 (1)認知力測試：在麻醉后各個時間節(jié)點對大鼠進行記憶力及認知功能測試，利用Morris水迷宮對大鼠進行定位航海測試及空間探索測試：撤去平臺，將大鼠從原平臺象限的右側(cè)象限入水，游泳2 min，記錄原平臺象限滯留時間百分比、原平臺象限運動距離百分比和原平臺象限進入次數(shù)百分比。(2)大鼠海馬體中α4-nAchR含量：在麻醉后各個時間節(jié)點用Western印跡法檢測大鼠海馬體α4-nAchR蛋白量：取大鼠一側(cè)海馬組織，勻漿、裂解、研磨，離心，取上清液，測定蛋白濃度，電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入α4-nAchR單克隆抗體過夜后加入二抗，洗滌后于自動曝光儀中曝光，與內(nèi)參 β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量；在麻醉后各個時間節(jié)點用RT-PCR法檢測大鼠海馬體α4-nAchR mRNA表達量：取大鼠一側(cè)海馬組織勻漿，加入1 ml Trizol 裂解，提取總RNA提取，根據(jù)沉淀物量加入無RNA酶水溶解 RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，配制反應(yīng)體系，加入相應(yīng)引物，分析結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1麻醉前大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期與總路程 隨著訓練時間的推移，麻醉前大鼠逃避潛伏期與總路程逐漸縮短，各組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1、表2。

表1 麻醉前各組訓練不同時間逃避潛伏期比較

表2 麻醉前各組訓練不同時間總路程比較

2.2麻醉后各組逃避潛伏期與總路程 麻醉后S3組2 h、24 h、72 h及S1組2 h、24 h逃避潛伏期與總路程與對照組相比均顯著延長；S2組2 h、24 h、72 h逃避潛伏期，2 h、24 h總路程與對照組相比均顯著延長，除72 h逃避潛伏期外，S3組較S1、S2組延長更為顯著(P<0.05)，見表3。

表3 麻醉后各組逃避潛伏期與總路程

2.3麻醉后各組空間探索能力對比 麻醉后S1組和S2組2 h、24 h，S3組2 h、24 h、72 h平臺象限滯留時間、平臺運動距離與對照組相比均顯著縮短，S3組較S1組縮短更為顯著(P<0.05)，見表4。

表4 麻醉后各組空間探索能力對比

2.4麻醉后各時間節(jié)點海馬體α4-nAchR mRNA表達情況 麻醉后各時間節(jié)點大鼠海馬體α4-nAchR蛋白與對照組相比均顯著下降，S3組較S1組下降更為顯著(P<0.05)，見表5、表6、圖1。

表5 麻醉后各時間點海馬體α4-nAchRmRNA表達

表6 麻醉后各時間點大鼠海馬體α4-nAchR的蛋白表達

1：24-nAchR;2:β-actin圖1 麻醉后各時間點海馬體α4-nAchR蛋白表達

3 討 論

認知功能是指大腦對外界信息進行加工處理并反饋的功能，包含了記憶、學習、表達等方面的內(nèi)容，一旦出現(xiàn)認知功能障礙，患者可出現(xiàn)記憶能力、學習能力、語言表達能力、理解能力的下降或減退。諸多因素均可影響認知功能，手術(shù)全麻引起的認知功能障礙在臨床上較為常見，有文獻報道新型吸入麻醉劑七氟烷雖具有誘導期短、蘇醒快等優(yōu)點，但可引起蘇醒后學習記憶和認知功能障礙〔4〕，常發(fā)生于術(shù)后3 d以內(nèi)〔5〕，但發(fā)病機制尚未十分明確，電生理學研究顯示，七氟烷可改變神經(jīng)元功能〔6〕，誘導神經(jīng)元凋亡，抑制新的神經(jīng)元的產(chǎn)生〔7〕，促進淀粉樣蛋白聚集，也可抑制乙酰膽堿受體電流〔8〕，4%的七氟烷引起的認知功能損傷可持續(xù)一個月之久。

海馬體是大腦中有關(guān)于學習和記憶功能的高級神經(jīng)活動中樞，可作為研究大腦學習和記憶力的理想模型〔9〕。海馬組織中的乙酰膽堿是目前發(fā)現(xiàn)的與學習、記憶功功能關(guān)系最為密切的神經(jīng)遞質(zhì)，有研究認為麻醉引起的認知功能障礙與煙堿型乙酰膽堿能受體的抑制相關(guān)。乙酰膽堿(Ach)是該主要通過毒蕈堿型(M)或煙堿型(N)受體發(fā)揮效應(yīng)。N型乙酰膽堿能受體是由乙酰膽堿激活的陽離子選擇性通道的配體門控通道受體，至今已確認有16種亞型，不同的亞型表現(xiàn)出不同的生理學特征。α4受體亞型是其中分布最多的受體亞型之一，廣泛存在于海馬體錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元，當其受到抑制時，可出現(xiàn)遺忘癥狀。七氟烷引起的認知功能障礙可能與α4nAchR表達下降相關(guān)，Solt等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥可以抑制α4神經(jīng)型，使人產(chǎn)生遺忘作用而發(fā)生認知功能障礙，但這種抑制是可逆的，隨著時間的推移，患者認知功能可逐漸恢復。Flood等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)吸入低濃度的異氟烷可以抑制 α4 nAchR 的表達，羅思琴等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，吸入3%濃度的七氟烷可使大鼠海馬體α7 nAchR 受體表達下降，引起認知功能障礙，也有研究認為七氟烷對成年及老年大鼠認知功能無影響〔13〕，目前有關(guān)于七氟烷對大鼠海馬體中α4 nAchR 表達的影響鮮有報道，本研究從α4 nAchR 入手，探討了七氟烷對大鼠認知功能的影響及機制。

在臨床上，運用七氟烷的有效劑量為1.2～1.5 MAC，換算到大鼠，1 MAC約為2.4%濃度〔14〕，為了觀察七氟烷對于大鼠認知功能的影響與吸入濃度的關(guān)系，本研究設(shè)置了1%、2%、3% 3個濃度組，對于大鼠認知功能的測定，選用了經(jīng)典的Morris水迷宮測試，水迷宮測試包括了定位航行實驗和空間探索實驗，前者主要檢測學習記憶力，后者則用來檢測記憶提取能力，目前廣泛運用于評價嚙齒類動物的認知功能〔15〕。本研究結(jié)果顯示吸入七氟烷后，大鼠學習記憶及提取能力均下降，且吸入濃度越高，影響越明顯，但隨著蘇醒時間的延長，認知功能逐漸趨向恢復，提示七氟烷對大鼠認知功能影響是可恢復的。對海馬體中α4 nAchR的研究發(fā)現(xiàn)，麻醉后各組大鼠α4 nAchR蛋白表達及mRNA表達均下降，吸入濃度越高，下降越明顯。

綜上所述，吸入七氟烷麻醉后可影響成年大鼠的認知功能，吸入濃度越高，認知功能障礙越明顯，這種影響可能與大鼠吸入麻醉后海馬體中α4 nAchR的表達下降相關(guān)。在將來的研究中，將進一步探討相同濃度下吸入七氟烷不同時間后對大鼠認知功能的影響，并將從更多的神經(jīng)遞質(zhì)及受體方面進行研究，深入探討七氟烷對認知功能影響的作用機制。