UFP-101對膿毒癥大鼠心功能及心臟HMGB1、TLR-4蛋白表達的影響

王一迪 韓毅,2 李占峰 陳司坤

(山西醫科大學 1麻醉學系，山西 太原 030001；2第二醫院麻醉科)

膿毒癥是指明確或可疑的感染引起的全身炎癥反應綜合征。嚴重膿毒癥是指膿毒癥伴有其導致的器官功能障礙和(或)組織灌注不足〔1〕，會引起心功能障礙，主要表現為心室擴張，心肌順應性減低，對液體復蘇和兒茶酚胺刺激的反應性下降等，是引起膿毒癥患者死亡的核心原因之一〔2〕。孤啡肽(N/OFQ)是孤兒阿片樣受體(ORL1)的內源性配體〔3〕，ORL1受體主要分布于人類的中樞神經系統(CNS)且在人類和大鼠心室肌及主動脈內皮細胞內也有表達〔4,5〕。研究證明〔6〕N/OFQ系統在膿毒癥患者體內被激活，而內源性N/OFQ受體拮抗劑(UFP-101)可以提高膿毒癥大鼠存活率，調節此病理狀態下大鼠免疫系統〔7〕。但內源性N/OFQ是否具體會影響膿毒癥的大鼠心功能以及相關機制尚不可知。高遷移率蛋白家族(HMG)B1作為一種膿毒癥晚期炎癥介質，與Toll樣受體(TLR)4結合促進炎癥因子表達上調〔8〕，并且會促進膿毒性心功能障礙〔9〕。本研究旨在探究UFP-101對不同時間段膿毒癥大鼠心肌組織內HMGB1及TLR4的基因分子水平調控及對心功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料 60只健康成年雄性SD大鼠，6～8周齡，體重250～280 g，購自山西醫科大學動物研究中心。本實驗中動物處置方法符合動物倫理血標準并經過山西醫科大學麻醉學系實驗動物福利倫理審批。實驗試劑：UFP-101(英國Tocris Cookson公司)；白細胞介素(IL)-6,腫瘤壞死因子(TNF)-α，HMGB1的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢博士得生物有限公司)；GAPDH一抗(英國Abcam公司)，兔HMGB1抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，兔TLR4多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，羊抗兔HRP-IgG二抗(英國Abcam公司)，總 RNA 提取試劑盒(9767)、逆轉錄試劑盒(RR047A)及擴增試劑盒(RR820A)均購于日本Takara公司。3-實驗儀器：BL-420N生物信息采集系統(成都泰盟)，酶標儀(Thermo公司)，ChemiDoc XRS凝膠成像分析系統(Bio-Rad公司)，MX3005P實時熒光定量PCR儀(上海拜力生物科技有限公司)分光光度計(UV-2800H，上海尤尼柯公司)。

1.2實驗分組 60只大鼠隨機分為三組：UFP-101組(U組)、盲腸結扎穿孔(CLP，C組)組與假手術(S)組，其中每組中隨機平均分為兩個時間段(CLP術后12 h，24 h)組，每個時間段10只。開始試驗之前，所有SD大鼠保持1 w靜養，可自由飲水、進食，本研究嚴格按照實驗動物倫理規定開展。

1.3建模與給藥方式CLP法建模方式 術前大鼠均保持6 h禁食狀態，腹腔內注射350 mg/kg 10%的水合氯醛(批準文號：國藥準字H37022673 生產廠家：青島宇龍海藻有限公司)，體位取仰臥位，將大鼠頭部及四肢固定好，選擇在大鼠中下腹部位置的作出一個手術切口，長度控制在1 cm左右，腹腔內所有臟器均暴露，對腸系膜行游離處理，經仔細探查之后將盲腸找到；在和盲腸根部距離1.5 cm的位置對盲腸根部行環形結扎處理；結扎遠端采用18號針頭行1次貫通穿刺處理，將少量糞便擠出，腸段行還納處理，并將大鼠腹膜及皮膚依次縫合好。

給藥方式：U組采用CLP建模法，術后立即經腹壁皮下注射0.03 mg/kg〔7〕負荷量的UFP-101，術后每隔6 h以同樣的方式注射等量的UFP-101，其中CLP術后12 h大鼠給藥3次，CLP術后24 h大鼠給藥5次。S組對盲腸進行探查之后，便馬上將腹壁切口縫合好，C組則采用CLP建模法，S組和C組大鼠同U組大鼠方式經腹壁皮下注射等量生理鹽水。

1.4相關指標測定方式

1.4.1血流動力學指標 分別用25%烏拉坦以5 ml/kg負荷量給各組CLP術后12 h，24 h大鼠腹腔注射麻醉，并行右側頸動脈插管直至左心室，連接生物采集系統，記錄心功能數據。

1.4.2ELISA檢測血清IL-6、TNF-α與HMGB1 各組大鼠心功能采集完成后被處死，取5 ml腹主動脈血，1 500 r/min離心15 min，獲取血清，行乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，保存在-80℃的環境中；血清IL-6、TNF-α及HMGB1均采用ELISA試劑盒法測定，各項操作均嚴格按照試劑盒說明書進行；各物質的光密度值均采用酶標儀進行測定，將標準曲線建立，并對血清中各種物質的含量進行計算。

1.4.3Western印跡檢測HMGB1，TLR4的蛋白表達水平 各組大鼠被處死后，開胸取大鼠心臟，用4℃生理鹽水沖洗，平均分為兩份，分別放入高壓蒸汽滅菌的EP管中-80℃保存。取50 mg左右組織進行蛋白提取，二喹啉甲酸(BCA)定量法檢測蛋白濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，封閉2 h，一抗(稀釋濃度均為1∶1 000)孵育過夜，二抗(1∶16 000稀釋)孵育1 h，TBST緩沖液清洗后用Quantity One圖像分析軟件測定各蛋白條帶灰度值，取HMGB1，TLR4條帶灰度與其相應內參GAPDH條帶灰度比值作為蛋白表達指標。

1.4.4RT-PCR檢測HMGB1，TLR4的mRNA水平 取20 mg左右組織進行mRNA提取，利用紫外可見分光光度計檢測mRNA純度，逆轉錄合成cDNA。將合成的引物cDNA進行PCR，采用2-ΔΔCt法對目的基因進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 利用RT-PCR技術檢測的蛋白及內參引物序列

1.5統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行方差分析，LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1術后各時期血流動力學指標對比 各組大鼠LVEDP，LVSP，MAP，HR，+dP/dt，-dP/dt等心功能指標在CLP術后24 h比術后12 h有所下降。與S組相比，C組與U組術后12h，24h的LVEDP，LVSP，MAP，HR，+dP/dt，-dP/dt均明顯下降，但U組較C組明顯上述指標增高(P<0.05)。UFP-101在大鼠CLP術后的應用對膿毒癥大鼠的心功能有所改善。見表2。

表2 3組SD大鼠術后各時期血流動力學指標對比

2.2術后12、24 h各組IL-6、TNF-α與血清HMGB1變化情況 U組、C組術后12 h IL-6和TNF-α的血清濃度高于術后24 h(P<0.01)，U組和C組血清IL-6和TNF-α濃度在術后各時間段較S組明顯上升(P<0.01)，但U組較C組各時間段血清IL-6和TNF-α濃度明顯下降(P<0.01)。U組和C組血清HMGB1濃度術后24 h較術后12 h明顯升高(P<0.01)，而S組無明顯變化，U組和C組術后各時間段血清HMGB1濃度較S 組明顯升高(P<0.01)，但U組較C組各時間段血清HMGB1濃度明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 CLP術后12 h，24 h各組大鼠血清IL-6、TNF-α與HMGB1變化

2.3術后12 h，24 h各組大鼠心肌組織內HMGB1，TLR4的蛋白及mRNA表達水平比較 術后12、24 h，C組，U組大鼠心肌組織HMGB1，TLR4蛋白表達水平及mRNA相對水平均明顯高于S組(P<0.05)，且U組上述指標水平也明顯低于C組(P<0.05)。見圖1，表4。

圖1 術后12、24 h Western印跡檢測各組大鼠心肌組織TLR4及HMGB1的相對表達

表4 術后12、24 h各組大鼠心肌組織HMGB1，TLR4蛋白及其mRNA相對表達比較

3 討 論

嚴重的膿毒癥的特點為血流動力學的改變和一個或多個器官的功能性衰竭，約有40%的膿毒癥患者可合并心肌抑制〔10〕，心功能的衰竭使膿毒癥患者的病死率增加2倍左右。膿毒癥引發的心功能障礙病理原因很多，一氧化氮(NO)、氧自由基的過度產生，TNF-α、IL-1β、IL-6〔11,12〕等炎癥因子對心肌組織的浸潤都是導致心肌抑制的重要因子。本研究說明，UFP-101可能降低膿毒癥大鼠整體炎癥反應，并且對其心功能有保護作用。

關于UFP-101以上對膿毒癥大鼠保護作用其機制可能如下，N/OFQ及其受體在外周血中性粒細胞內表達，炎癥反應過程中中性粒細胞對N/OFQ的釋放增多，這些N/OFQ可促進中性粒細胞和單核細胞的趨化，并且促進炎癥因子的釋放〔13〕，間接抑制心肌功能。N/OFQ也可能直接調節心血管系統，大鼠心肌細胞中有OLR1的表達，外源性給予N/OFQ 會劑量依賴性地降低心臟的舒縮功能，部分原因是因為N/OFQ作用其受體后抑制心肌細胞L型鈣電流〔14〕。UFP-101不僅阻斷N/OFQ對心臟的直接抑制作用并且降低其對炎癥細胞的趨化作用，抑制炎癥因子的釋放從而保護心臟功能。

HMGB1，TLR4通路近年來成為新的抗炎治療研究靶點，不同于其他炎癥因子，HMGB1受到內毒素及其他炎癥因子刺激后開始釋放，入血漿的時間在8 h后，屬于晚期炎癥介質〔15〕。HMGB1含有兩個可折疊的DNA結合區：A box和B box〔16〕，其中B box 含有促炎癥的結構域，HMGB1能通過與TLR4受體作用激活下游核因子(NF)-κB通路〔17〕，進而促進炎癥因子的表達增加患體的器官損傷及死亡的風險。研究證明HMGB1可以在內毒素刺激下由活心肌細胞釋放，并且可能通過旁分泌作用于相鄰心肌細胞TLR4受體降低心肌收縮能力〔18〕。本研究說明UFP-101對心肌組織HMGB1和TLR4有下調作用，也有可能降低了浸潤心肌組織的免疫細胞所表達的HMGB1，這一效應能夠降低HMGB1-TLR4-NF-κB通路激活的促炎作用及對心功能的損傷作用〔19〕。UFP-101調控心肌組織及循環系統內的TLR4，HMGB1的機制可能性很多，其中內源性N/OFQ受體所激活的下游蛋白激酶(PK)C及細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2通路〔20〕，有可能對HMGB1，TLR4蛋白〔21〕產生上調作用，而UFP-101通過阻斷N/OFQ的下游作用，至少部分引起HMGB1，TLR4的下調，進而對濃度癥大鼠炎癥反應及心功能起到緩解保護作用。