單唾液酸四己糖神經節苷脂對大鼠腦出血后PAPR-1/AIF通路的影響

張雙 鄧華江 張麗云 劉洛同 唐興江 梁雪梅

(西南醫科大學附屬醫院 1老年病科，四川 瀘州 646000；2神經外科；3健康體檢中心；4神經內科)

目前，不論是顯微手術的運用，還是臨床藥物、高壓氧等的綜合治療，雖然一定程度上使腦出血病情得到改善，但是其神經功能的恢復效果仍不盡人意。如何更好地促進腦出血導致的神經功能障礙恢復仍是研究的重點及難點。研究證實，細胞凋亡程序的啟動也參與了腦出血后的繼發性損傷〔1,2〕。同時，多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1/凋亡誘導因子(PARP-1/AIF)介導的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)非依賴性的細胞凋亡通路在細胞凋亡過程中發揮著重要作用〔3～5〕。單唾液酸四已糖神經節苷脂(GM1)廣泛存在于中樞神經系統灰質中，其參與了神經系統的發育過程，具有神經保護作用。當中樞、外周神經受損或內源性GM1不足時，通過補充外源性GM1可起到明顯的早期腦保護作用〔6〕。當腦組織缺血再灌注損傷后，外源性GM1可起到抗凋亡作用〔7〕。但目前GM1抗凋亡作用機制尚不明確，同時其在腦出血損傷中的應用也未見報道。本研究探討GM1對大鼠腦出血后神經功能障礙的影響及可能機制，為更好地治療腦出血提供一定的實驗依據，也為腦出血治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組、藥物及器材 80只健康SD大鼠(300～350 g)由西南醫科大學動物實驗中心提供，隨機分為4個組：假手術組(n=5)，腦出血組(n=25)，小劑量組(n=25)，大劑量組(n=25)；單唾液酸四己糖神經節苷脂(山東齊魯制藥廠)；WDT-V型大鼠腦立體定位儀(西南醫科大學神經生物學教研室)，50 μl微量注射器(上海市安亭微量進樣器廠)；Leica DM2500顯微鏡(德國Leica公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；一抗兔抗鼠凋亡誘導因子(AIF)多克隆抗體(巴傲得生物科技有限公司)；一抗兔抗鼠PARP-1、Bax,Bcl-2抗體多克隆抗體(巴傲得生物科技有限公司)；二抗快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物(邁新生物技術開發有限公司)；抗體稀釋液(上海基因公司)。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠腦出血模型的建立 將大鼠麻醉后，置于36.5～37.5℃溫臺上，取俯臥固定于立體定位儀上，調整立體定位儀的水平定位針，大鼠頭部至正中位，于頭頂部正中切開長約8 mm縱行切口，分離頭皮暴露顱骨，將微量注射針固定于立體定位儀上，調整位置，使針尖移動至大鼠顱骨中線右旁3 mm，前囟前方0.2 mm，骨鉆開顱骨，斷尾取血50 μl于微量注射針內，將針尖移動至已鉆好的顱孔內，并向顱內進針6 mm，將血勻速注入大鼠腦尾狀核，注血速度約10 μl/min，完成后留針5 min，之后緩慢退針(約1 min)，封閉顱骨并縫合皮膚，手術整個過程均為無菌操作。假手術組：除不斷尾取血注入腦組織外，其余步驟均一致。除假手術組外，其他各組又分別按處死時間分為6 h、1 d、3 d、5 d、7 d共5個亞組，小劑量及大劑量組大鼠于腦出血手術后即刻按體重分別經腹腔注射小劑量(15 mg/kg)和大劑量(30 mg/kg)GM1各一次，之后每天同一時間按相同劑量給藥直至處死，假手術組和腦出血組大鼠于每天相同時間點腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2神經功能評分 依照Garcia等評分方法進行神經功能評分，分數越低則神經功能障礙越重〔8〕。

1.2.3腦組織細胞凋亡程度定量分析 采用TUNEL染色法對大鼠腦組織細胞凋亡情況進行檢測，從每只大鼠中選取5張染色切片，然后置于400倍光學顯微鏡下，選取連續6個無重疊血腫周圍組織的視野區進行觀察，并對TUNEL染色陽性表達的細胞采用Image-Pro-Plus圖像進行分析系統計數。

1.2.4Western印跡檢測 大鼠在造模后72 h處死，并置于低溫條件下快速提取大鼠腦組織蛋白，測定蛋白濃度，隨后提取蛋白樣品50 μg進行上樣、電泳之后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；以3%牛血清白蛋白(BSA)液封閉1 h，然后加入相關一抗于4℃孵育過夜；用PBST洗膜3次，每次洗膜約5 min；隨后加入與一抗相對應的二抗，并在室溫下輕搖孵育2 h；再次洗膜3次，以電化學發光(ECL)顯影液將膜在ChemiDocXR+凝膠成像儀中予以曝光顯影，采集相關信息，用Image Lab程序進行條帶分析，檢測PARP-1，AIF，Bcl-2 和Bax蛋白表達變化情況。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行重復測量方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1GM1對大鼠腦出血后神經功能障礙的影響 除假手術組外，其余各組均在術后出現不同程度的神經功能損傷癥狀，如：血腫對側肢體癱瘓、“追尾征”等行為學改變，且在術后神經功能評分逐漸下降，于術后第2～3天降至最低。與腦出血組相比較，治療組在對應的各時間點大鼠神經功能障礙均得到顯著緩解(P<0.05)，且大劑量組顯著優于小劑量組(P<0.05)。見表1。

2.2GM1對大鼠腦出血后細胞凋亡的影響 腦出血組及GM1治療組鏡下均可見明顯的TUNEL陽性表達，凋亡細胞明顯多于假手術組，且在術后第2～3天達到高峰，隨后逐漸下降。經GM1治療后細胞凋亡數量相對腦出血組減少，且存在量效關系(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組腦出血術后細胞凋亡數量及各時間點神經功能評分

圖1 各組腦組織TUNEL染色(×400)

2.3GM1對PARP-1及AIF表達的影響 假手術組腦組織中PARP-1及AIF蛋白表達量均較低。當腦出血后PARP-1、AIF蛋白表達量明顯增加(P<0.05)，且于術后第3天達到峰值，小劑量組和大劑量組中PARP-1、AIF的表達均出現不同程度的下調，且大劑量組下調程度大于小劑量組(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 腦出血后3 d PARP-1及AIF表達比較

圖2 Western印跡檢測PARP-1、AIF蛋白表達

2.4GM1對Bcl-2及Bax表達的影響 假手術組腦組織中Bcl-2蛋白高表達，而Bax低表達，Bax/Bcl-2比值(0.15±0.06)較低。當腦出血后Bax蛋白表達明顯上調(P<0.005)，且于術后第3天達到峰值，而Bcl-2表達趨勢與之相反，Bax/Bcl-2比值(3.07±0.16)增高。但經GM1干預后大、小劑量組Bax蛋白表達出現不同程度的下調，而Bcl-2出現上調，Bax/Bcl-2比值(0.75±0.10、1.36±0.15)下降，且大劑量組變化程度大于小劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖3 Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討 論

腦出血后廣泛存在著細胞凋亡現象〔9〕,細胞凋亡程序的啟動參與了腦出血后的繼發性損傷，加重腦出血后神經系統功能障礙，除了經典的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)介導的死亡受體途徑外，非半胱天冬酶介導的凋亡途徑也是一條重要的細胞凋亡途徑，其中包括經典的聚PARP-1/AIF介導的凋亡途徑〔10〕。

PARP-1是一種含量豐富的核蛋白，廣泛存在于細胞核內，在生理條件下具有調節細胞穩定和保護基因穩態性的作用，而當腦組織損傷、細胞缺血缺氧情況下，DNA大量損傷可促使PARP-1過度激活，導致神經元損傷及凋亡，最終導致嚴重的神經功能障礙。因此PARP-1的激活程度可能是調節DNA損傷后細胞死亡或存活的關鍵因素。研究發現，PARP-1過度激活可加重腦缺血缺氧性損害，PARP-1抑制劑或PARP-1基因敲除均可顯著減輕神經元死亡〔11,12〕。AIF是PARP-1重要的下游因子，當神經元缺血缺氧后，PARP-1被大量激活，使細胞質內PAR聚集，并向線粒體內轉位，促進線粒體內AIF釋放，進入細胞核中，導致染色質凝集和DNA大片段斷裂，導致細胞凋亡〔13，14〕。Bcl-2及Bax是bcl-2基因家族中具有代表性的凋亡相關蛋白，Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bax則為促凋亡蛋白，Bax/Bcl-2的比值對細胞的凋亡進行調控，比值越小，則抑制細胞凋亡，比值越大，則促進細胞凋亡〔15〕。

本研究證實了腦出血后PARP-1/AIF介導的細胞凋亡途徑被激活并在此病理生理過程中起到重要的作用。

神經節苷脂具有促進神經元再生和神經功能恢復作用，同時對受損細胞分化功能的維持和生存起重要作用。GM1是最重要的神經節苷脂之一。當腦組織缺血缺氧，GM1含量明顯下降，而外源性GM1可透過血腦屏障，嵌入受損的神經細胞膜上，進而啟動其神經保護作用〔16〕。本研究提示GM1對腦出血后PARP-1、AIF表達及Bax/Bcl-2具有一定的調節作用，且存在量效關系。

綜上所述，GMI對大鼠腦出血后神經功能具有保護作用，其作用機制可能是通過調節PARP-1/AIF通路進而抑制腦出血后細胞凋亡途徑。但關于GM1如何作用于PARP-1發揮神經保護作用，仍有待進一步研究。