新疆特色果蔬中乳酸菌分離鑒定及其抑菌活性

孫海龍， 李佳益， 張 敏， 曾傲瓊， 倪永清*

（1.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

長期研究發現，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少，且在人體中具有重要生理功能的有益菌，它們在人類腸道中起著很大生理作用。這些有益菌擁有抗酸和膽汁、粘附人類上皮細胞、在人類腸道中繁殖、產生有機酸、細菌素等抗菌物質的特性。

以乳酸菌為生物保鮮劑用于果蔬和肉制品的保鮮已有不少報道[1-2]。Martinez等[3]將Lactobacillus plantarum菌液噴涂于荔枝、紅毛丹果實表皮，發現能夠降低致病菌的數量，同時還能抑制其褐變保持果皮的色澤、降低水分損失，延長果實貨架期。果蔬富含礦物質、維生素、膳食纖維和抗氧化劑等有益的營養物質，且沒有限制少數特定群體消費的乳品過敏原，因此使得果蔬成為傳遞益生菌的理想載體[4]。Raffaello等以卷心菜為原料[5]，將 Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii加入滅菌的未添加其他營養物質的卷心菜汁里，乳酸菌能快速繁殖，30℃發酵48 h后，細胞數量高達108cfu/mL，且Lactobacillus.plantarum、Lactobacillus.delbrueckii比Lactobacillus.casei能產生更多的可滴定酸。

由于易受到快速腐敗微生物及一些病原體污染，新鮮的水果和蔬菜保質期較短，很容易腐爛變質。巴氏滅菌以及添加化學防腐劑是保證果蔬安全的主要技術操作，但同時也會帶來如物理特性、化學成分變化等不理想的改變[6]。為避免這些缺陷，利用產細菌素等抗菌物質的乳酸菌，開發果蔬汁益生菌功能飲料以及作為天然抗菌防腐劑應用于果蔬貯藏保鮮等新技術備受關注[5，7-9]。具有產細菌素能力的乳酸菌對不同食物腐敗或病原菌都表現出一定的抑制能力，且具有安全、無殘留、抗菌譜廣等優勢，這類產細菌素的乳酸菌在乳品加工、果蔬加工、水產品、肉制品等領域的應用已經取得顯著成果[10-12]。許多研究已經證明[3，5-6，13-14]，添加產細菌素的乳酸菌到食品中比直接添加細菌素更可取。作為一類天然的、安全的食品抗菌防腐劑，乳酸菌可以較好地抑制致病菌及腐敗菌的生長，從而保證食品的質量，提高食品的安全性；這使得乳酸菌作為抗菌防腐劑在食品保鮮技術中的優勢日漸凸顯，在未來天然食品生物防腐劑研究與開發中有極大的應用潛力。

新疆盛產瓜果、蔬菜，且營養高、口感好。由于新疆特殊的地理環境及氣候多變性，較好地保存了當地自然環境中的有益微生物，是乳酸菌的天然儲存庫。對新疆不同地區水果中乳酸菌進行分離、鑒定及生物學特性研究，篩選出具有抑菌活性的乳酸菌，為進一步開發果蔬汁益生菌功能飲料及加速天然食品防腐劑在食品保鮮中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從新疆不同地區（伊犁、塔城、喀什、石河子等地）用提前滅菌的工具采集野生沙棘、沙棗、蘋果、海棠果、山楂、石榴、葡萄、庫爾勒香梨等樣品（每種取樣2～3份），裝入提前滅菌的保鮮盒內，貼上標簽后放置于車載冰箱-4℃冷藏，當天運回實驗室。樣品立即在無菌條件下處理，將其表皮用滅菌刀具削下放入裝有30 mL MRS液體培養基的錐形瓶中，30℃搖床振蕩培養12 h，4℃保藏備用。

1.2 主要試劑和儀器

用于PCR擴增的全套試劑均購自TaKaRa公司。所用培養基及相關藥品均購自海博生物技術有限公司。生理生化試驗所用試劑購自天津市巴斯夫化學試劑廠。PCR儀為德國Biometra公司的Tprofessional；凝膠成像儀為美國BioRad公司Gel DOC XR；水平電泳儀為美國BioRad公司的PowerPac Universal。

1.3 菌株分離純化

采用梯度稀釋平板涂布法分離樣品中的乳酸菌。取 10-2、10-3、10-43 個梯度稀釋樣品 150 μL 分別涂布于MRS、Elliker、M17、乳酸桿菌選擇性瓊脂4種固體培養基上，一式兩份，37℃厭氧培養2 d。待菌落長出后挑取單菌落，劃線培養3次后，將所得純培養物轉接到MRS液體培養基[15]。菌株的細胞形態、菌落形態、生理生化實驗參照文獻進行[16]，通過革蘭氏染色和接觸酶實驗進行初篩，初步確定疑似乳酸菌。

1.4 菌株rep-PCR指紋圖譜分析

采用CTAB法提取菌株單菌落DNA。用引物GTG5 （5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′） 對分離菌株DNA進行PCR擴增[17-18]。反應在25 μL體系中進行， 包括 2×PCR Master Mix 12.5 μL，0.5 μmol/L MgCl22.0 μL， 引物 1 μL，2 μL 的模板以及 7.5 μL的ddH2O。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；40℃退火 30 s；65 ℃延伸 8 min；32 個循環；72℃終延伸16 min。PCR結束后，擴增產物經質量濃度為14 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測2 h。在紫外凝膠成像儀中觀察電泳結果，DNA帶型完全一致的菌株被認為屬于同一物種，從中選取表菌株作進一步16S rRNA基因測序分析。

1.5 16S rRNA基因測序及系統發育分析

用引物 27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對菌株進行16S rRNA基因擴增[17，19]。擴增條件：94℃預變性 4 min，94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸1 min，共30個循環；72℃終延伸10 min。PCR擴增產物經純化后送至上海生工生物技術有限公司測序，將所得序列提交到GenBank數據庫中，利用BLAST進行序列同源性分析，比較供試菌株與已知乳酸菌相應序列的相似性。在MEGA 6.0軟件中用p-distances和Kimura-2parameter雙參數法構建系統發育樹，并進行1000次Bootstraps檢驗[20]。

1.6 牛津杯法篩選具有抑菌活性的乳酸菌

分別吸取100 μL指示菌 （金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、單增李斯特菌 Listeria monocytogenes）稀釋液（活菌數達到2.0×108cfu/mL）涂布于已凝固的LB固體培養基，用滅菌棉簽均勻涂抹，在每個平板中等距放置4個牛津杯，再分別加入200 μL的乳酸菌上清液，用未加菌液的培養基為空白對照[21]。放置于4℃冰箱中擴散5 h后，在37℃培養箱中培養16 h。若在牛津杯周圍出現抑菌圈，則表示該菌株可以產細菌素，具有抑菌活性；用游標卡尺測量抑菌圈直徑，每株菌做3個平行，求平均值。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌生理生化鑒定

從沙棘、沙棗、蘋果、海棠果、山楂、葡萄、紅棗等樣品中共分離得到純培養物137株。通過革蘭氏、接觸酶實驗初步確定疑似乳酸菌共90株。如圖1所示，菌株菌落形態大多為白色或乳白色，邊緣整齊，直徑在0.5～2 mm之間，表面較濕潤，易于挑起。90株植物菌株中有32株菌落顏色呈白色，36株菌落顏色呈乳白色，17株菌落顏色呈淡黃色；透明或半透明狀4株，淡灰色1株。鏡檢發現，大多數分離菌株細胞形態呈桿狀或球狀。

圖1 乳酸菌菌落形態及其細胞形態Fig.1 Colonies and cell morphology of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌16S rRNA基因序列鑒定及其系統發育

DNA帶型完全一致的菌株通常被認為屬于同一物種。對90株疑似乳酸菌通過rep-PCR指紋圖譜表征分析，顯示出15種不同的DNA帶型。結合表性特征及指紋圖譜結果，選取15株代表菌株進行16S rRNA基因擴增及測序分析。

將測序得到的序列提交到NCBI，在GenBank數據庫中利用BLAST在線工具與已知的16S rRNA基因序列進行同源性比對，選取相似度最高的序列，分析其親緣關系并建立系統發育樹。結果如表1所示，16S rRNA鑒定結果表明分離菌株主要隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬 Leuconostoc）和乳球菌屬（Lactococcus）3個屬。其中Lactobacillus 6株， 包括 Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillusplantarum 5 個 種 ；Leuconostoc 8株，包括Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc pseudomesenteroides、Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum 3個種；而Lactococcus只分離到一株B-11-5，屬于Lactococcus lactis。

由系統發育樹可知（圖2），被測菌株16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中同源性相似性在98%～100%之間。 M-PC-4、M-PC-12、M-PC-15、MPC-17、M-PC-18、M-PC-19 聚為一群，均屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）；其中 M-PC-4 與 Lactobacillus plantarum，M-PC-12 、M-PC-19 與 Lactobacillus alimentarius，M -PC -17 與 Lactobacillus paralimentarius，M-PC-18 與 Lactobacillus kimchii的相似度均達到了100%；M-PC-15與Lactobacillus paraplantarum的相似度達到了99%，因此它們均隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）。M-5-1、E-5-7、M-6-3、B-5-12、M-11-13、M-11-13 與 Leuconostoc mesenteroides的相似度為99%～100%之間，M-5-6、E-5-8與Leuconostoc pseudomesenteroides的相似度為100%，可以確定屬于明串珠菌屬（Leuconostoc）。 而 B-11-5 與 Lactococcus lactis的相似度為100%，在系統發育樹上形成一個單獨分支。

表1 乳酸菌鑒定及表型特征Table 1 Identification and phenotypic characteristics of Lactic acid bacteria

2.3 具有抑菌活性乳酸菌的篩選

乳酸菌通常能夠抑制與其種屬相近的菌株，利用15株已鑒定的乳酸菌作為目標菌，分別以金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌作為指示菌篩選具有抑菌活性的菌株。結果顯示分別來自Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus.alimentarius、Lactobacillus. paraplantarum、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis 5個種的乳酸菌具有抑制指示菌生長的能力。不同乳酸菌所產生的抑菌圈直徑在8～20 mm范圍內 （牛津杯直徑為7 mm）；抑菌效果由表2可知，不同種乳酸菌對不同指示菌的抑菌程度不同，如圖3所示。

圖2 基于16S rRNA序列的菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of the 16S rRNA gene

表2 對指示菌抑菌活性Table 2 Antibacterial spectrum for indicator bacteria

圖3 產細菌素乳酸菌的篩選Fig.3 Screening for bacteriocin-producing strains

3 結語

本研究利用4種培養基對8種新疆不同地區水果表皮可培養乳酸菌分離進行了分離純化。16S rDNA序列分析確定15株代表菌株分別隸屬于乳桿菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬3個屬，共8個種。抑菌研究結果表明，Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis 5個種的8株乳酸菌對不同指示菌在一定程度上都有抑制作用，不同種乳酸菌對不同指示菌的抑菌程度不同。

本研究從不同水果中分離所得乳酸菌主要是Leuconostoc和 Lactobacillus， 尤 其 Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum是水果表皮的優勢菌群，并且以其作為生物保鮮劑用于果蔬貯藏保鮮已有不少報道[1-3，5，7-8，14]。 明串珠菌和乳桿菌屬菌株多數都能抑制金黃色葡萄球菌和李斯特菌的生長，但對枯草芽孢桿菌的抑菌效果并不明顯。目前，Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcus lactis 是 果 蔬乳酸發酵中最常見的菌種[1，5，22]。 有研究指出[6，22]，乳酸發酵過程中，當果蔬汁作為唯一的發酵底物時，由于葡聚糖蔗糖酶的合成，明串珠菌可選擇性地促進一些乳桿菌和雙歧桿菌的生長，從而平衡腸道微生物組成。Raffaella等通過 Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii等研究了番茄汁是否適合生產益生菌產品，結果表明，4種乳酸菌都能在沒有調節番茄汁PH和補充營養物質的情況下，快速繁殖并產酸。且在4℃冷藏4周后，L.plantarum、L.delbrueckii依然能在低pH、高酸度條件下生存[5-6]。L.plantarum具有較廣的抑菌普，能抑制多種致病菌的生長。Martinez等[3]用L.plantarum菌液噴涂荔枝，并在10℃條件下貯藏，延緩了果皮褐變。李轉羽等[6，23]研究發現，除金黃色葡萄球菌、李斯特菌等革蘭氏陽性菌外，L.plantarum對沙門氏菌、志賀氏菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌也有明顯抑制作用。

本研究前期對新疆不同地區水果中的乳酸菌進行了分離鑒定，并對具有抑菌活性的乳酸菌進行了初步篩選。后續研究中，會對分離菌株的生長特性及抑菌能力進行拓展實驗，以期更加準確地了解其抑菌活性及相關抑菌物質的功能性質。為進一步開發果蔬汁益生菌功能飲料及加速天然食品防腐劑在食品保鮮中的應用奠定基礎。