混合菌種和鹽含量對發酵鰱魚肉品質的影響研究

石建喜， 許艷順， 姜啟興， 盧素芳， 夏文水

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.武漢市水產科學研究所，湖北 武漢 430207）

我國是漁業大國，2014年水產品總產量6 172.00萬t，其中養殖淡水魚類總產量2 481.73萬t，但是我國淡水魚加工比例仍較低，不足15%，嚴重制約了我國淡水漁業的發展。鰱魚作為產量僅次于草魚的淡水魚類，肉質鮮嫩，營養豐富，但由于其肉薄刺多、土腥味較重的問題，導致鰱魚的消費量受到極大限制。腌制發酵是一種水產品傳統保藏加工技術，腌制發酵過程中，產品的理化特性、微生物群以及感官特性發生變化，最終引起產品風味、質構、色澤以及其他品質特征的改善，以更好地滿足消費者需求。但由于傳統發酵都是利用自然界的微生物在適宜的溫濕條件下發酵而成，發酵過程難以控制[1]。

近年來，利用現代微生物接種技術提升傳統發酵魚制品品質已引起廣泛關注，將自傳統發酵制品分離的菌種接種到產品中，能夠縮短產品的生產周期和提高安全性。微生物發酵菌種以及發酵工藝條件對最終產品風味和食用品質有著重要影響。本研究室前期以鰱魚為原料，采用單一和混合發酵劑對淡水魚糜進行發酵，得到了具有獨特風味、高凝膠強度的發酵魚糜制品[2-6]；Adams等人[7]研究了乳酸菌發酵魚糜的影響因素，發現隨含鹽量增加pH降低速率減緩；現有研究主要針對發酵菌種篩選、魚糜發酵過程中品質變化方面，對微生物接種發酵、鹽含量對發酵魚塊品質以及風味的影響還鮮有報道。

因此，本研究選用從傳統發酵魚制品中篩選出的植物乳桿菌120、釀酒酵母152、木糖葡萄球菌135作為混合發酵劑在20℃條件下發酵鰱魚塊，比較分析兩種鹽濃度條件下魚肉理化、微生物及風味品質變化，為利用現代微生物發酵技術提升傳統腌制魚制品風味品質和安全性提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 鰱魚：鮮活，購于無錫市華潤萬家超市，質量2.5±0.2 kg，去除頭、內臟，用清水沖洗干凈后切成長、寬、厚為 5±0.2 cm×5±0.2 cm×2±0.2 cm的魚塊。

菌種：植物乳桿菌120、釀酒酵母152、木糖葡萄球菌135分離于自然發酵酸魚，均由江南大學食品學院提供。

1.1.2 主要儀器設備 分光光度計：UV2100型，上海尤尼柯儀器公司；冷凍離心機：4K15型，SIGMA公司；均質機：T10型，廣州儀科實驗室技術有限公司；氣相質譜連用儀：QP2010 plus型，日本島津公司；電子分析天平：AB104-N型，梅特勒-托利多儀器有限公司；電熱恒溫培養箱：HH-B11.420-BS型，上海躍進醫療器械廠；電熱鼓風干燥箱：GZXGF101-1BS型，上海躍進醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵鰱魚的制備 實驗分4組：①鹽質量分數5%；②鹽質量分數3%；③鹽質量分數5%，加1%混合發酵劑；④鹽質量分數3%，加1%混合發酵劑。混合發酵劑植物乳桿菌120、釀酒酵母152、木糖葡萄球菌135添加比例為1∶1∶1。4組實驗均加入質量分數1%的葡萄糖做碳源，在20℃發酵48 h。

1.2.2 混合發酵劑的制備 將菌種植物乳桿菌120、釀酒酵母152和木糖葡萄球菌135分別接種在不同的培養基上活化培養，重復操作3次。將培養的菌種菌液于4℃、10 000 r/min離心10 min，然后用無菌生理鹽水洗滌兩次，再懸浮于無菌生理鹽水中。最后將菌液濃度調整到105～106cfu/mL，將菌液于4℃保存，并于24 h內使用。

1.2.3 微生物分析 取25 g樣品于無菌均質袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，用均質拍打器均質3 min。吸取上清液1 mL，將樣品等梯度稀釋。選擇3個合適稀釋度，每個稀釋度取0.1 mL分別加入不同的選擇性培養基中，采用稀釋涂布的方法對微生物計數。菌落總數用平板計數瓊脂（PCA）培養基，37℃培養2 d；乳酸菌用MRS培養基在30℃培養2 d；酵母菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基在30℃培養36 h；葡萄球菌用高鹽甘露醇瓊脂（MSA）培養基于30℃培養2 d；假單胞菌用CFC選擇培養基于26℃培養72 h；腸桿菌用結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBA）雙層培養基在37℃培養24 h。

1.2.4 pH值的測定 精確稱取10 g魚肉，加100 mL蒸餾水用高速分散機勻漿1 min，勻漿結束后立即用pH計測定勻漿物的pH值，重復測定3次。

1.2.5 總酸含量的測定 參照Ikenebomeh法[8]，總酸度用乳酸表示。

1.2.6 揮發性鹽基氮（TVBN）含量的測定 按照國標GB/T2003稍微修改進行測定。

1.2.7 氨基態氮（ANN）含量的測定 采用甲醛滴定法[9]。

1.2.8 脂質氧化的測定 用硫代巴比妥酸（TBA）表示氧化酸敗的程度。取2 g碎肉，加入20 mL 10%三氯乙酸溶液高速均質30 s，4℃2 000 g離心5 min，將上清液進行過濾，取過濾液5 mL與5 mL 0.02 mol/L TBA溶液混合，沸水浴加熱20 min，迅速冷卻20 min，在532 nm處測吸光值。空白由5 mL三氯乙酸溶液與5 mL TBA溶液混合。TBA值用丙二醛（MDA）質量分數表示，單位為mgMDA/kg樣品。

1.2.9 GC-MS測定揮發性風味物質 （1）揮發性風味物質的提取。采用固相微萃取的方法提取風味物質。取魚肉2 g，萃取溫度為50℃，萃取時間為60 min。將萃取頭插入氣相色譜進樣口250℃解析3 min，取樣3次，進行平行操作。（2）GC-MS測定。氣相色譜條件：彈性毛細管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣氦氣流量為 0.81 mL/min，不分流進

圖1 不同發酵條件下鰱魚發酵過程中微生物的變化Fig.1 Microbiological changes in sliver carp during fermentation under different condition

樣，進樣口溫度維持250℃。起始柱溫40℃維持3 min，然后以5℃/min升溫至120℃，保持5 min，再以15℃/min升溫至240℃，保持5 min。質譜條件：離子源溫度200℃，四級桿溫度150℃，電子電壓70 eV。

1.2.10 數據處理 數據用Origin 8.5統計作圖，利用SPASS 22.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 鰱魚發酵過程中微生物變化

鰱魚發酵過程中微生物的變化見圖1。微生物是影響發酵鰱魚最終品質的重要因素，本實驗主要對菌落總數、乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌、腸桿菌以及假單胞菌等6種菌種進行了分析。由于鹽質量分數較低，在3%～5%的含鹽量范圍內，鹽質量分數對微生物生長的影響并不明顯。

由圖1（a）可知，隨著發酵的進行，0～24 h菌落總數快速增加，24～48 h增長速度變緩，說明后期乳酸菌代謝產生的有機酸、細菌素等抑菌物質對微生物的增長產生了抑制作用。發酵初期，由于發酵劑直接注射入發酵液中，因此接種組與對照組的差異并不是很明顯。但乳酸菌（圖1（b））隨著發酵時間的增加而增加，對照組的乳酸菌數明顯低于接種混合發酵劑組，接種組發酵24 h時菌落數對數值已達到7.58～8.46，而對照組在36 h時最高僅為8.45，接種組在36 h時已達到9.36～9.59。且乳酸菌與總菌數變化趨勢相似，因此推斷乳酸菌為鰱魚發酵過程中的優勢菌。

酵母菌和葡萄球菌對鰱魚風味物質的形成具有重要作用。由于接種組中加入酵母菌，所以發酵前12 h，增長速度較對照組迅速，直至24 h時，接種組增速開始減緩；48 h時數量差異已不是很明顯（圖1（c））。酵母菌可以通過消耗過氧化物和氧氣來抑制亞硝基肌紅蛋白的降解和產品的腐敗[10]。

接種組中葡萄球菌數量高于對照組，接種組和對照組均維持快速增長，當到達24 h時，接種組開始出現明顯下降趨勢，對照組雖在增加卻速度變緩，這可能是由于pH的降低造成的，因為在存在耐酸細菌的環境中，葡萄球菌競爭性相對較弱[11]且酸度的增強抑制了葡萄球菌的生長。

腸桿菌、假單胞菌是發酵魚產品中的致病菌，所以對產品安全有重要的影響。發酵前12 h，假單胞菌數量在3.5～3.6，腸桿菌數量在2.2～2.6，由于營養物質豐富，腸桿菌和假單胞菌迅速增加，但隨著時間延長，乳酸菌等優勢菌的快速增長使其生長受到競爭，且pH的降低也不利于其生長，削弱了有害菌的生長環境，因此發酵至36 h時均有先增長迅速后增長平緩的趨勢。繼續發酵，實驗組中腸桿菌、假單胞菌和葡萄球菌出現明顯降低，推測是受pH值以及抑菌物質的影響產生的。

2.2 添加混合發酵劑對理化指標的影響

2.2.1 鰱魚發酵過程中pH值和總酸含量（TA）的變化 pH值和TA的變化如圖2所示，發酵初期，魚肉pH值均在6.5～6.8。隨著發酵時間的增加，0～12 h pH值和TA值變化較為緩慢，24 h時pH值明顯下降，TA值上升，由此可知微生物在此時間范圍內生長迅速，使pH值迅速下降，抑制有害微生物的生長。發酵48 h時，接種組的pH值明顯低于對照組，當接種組pH值為4.23～4.44時，對照組的pH仍保持在5左右，說明加入混合發酵劑后發酵時間明顯縮短，且pH的降低伴隨著明顯的TA值升高，與前面的乳酸菌的增長相一致。3%和5%食鹽含量的兩接種組，前者pH值變化更明顯。

圖2 不同發酵條件下鰱魚發酵過程中pH和TA的變化Fig.2 pH andTA changesin slivercarp during fermentation under different conditions

2.2.2 鰱魚發酵過程中揮發性鹽基氮（TVBN）的變化 由圖3可知，不論在何種發酵條件下，隨著發酵時間的增加，TVBN值均增加；48 h時，接種組質量分數分別為0.188 7和0.192 2 mg/g，對照組質量分數分別為0.232 1和0.254 5 mg/g，已開始出現腐敗特征。根據微生物生長情況可知，乳酸菌的快速生長降低了pH，并產生其他抑菌物質，明顯抑制腐敗菌的生長，并抑制TVBN的增加。兩接種組間雖最后差別不是很大，但5%食鹽質量分數組TVBN增長速度明顯較3%食鹽組快。

圖3 不同發酵條件下鰱魚發酵過程中TVBN的變化Fig.3 TVBN changes in sliver carp during fermentation under different conditions

2.2.3 鰱魚發酵過程中氨基態氮 （ANN）的變化氨基態氮含量可以反映發酵魚肉的蛋白水解程度。由圖4可知接種混合發酵劑的發酵魚肉的ANN含量均高于對照組，除了因pH值的降低提高魚肉中的酸性蛋白活性外，與乳酸菌和木糖葡萄球菌本身產生的蛋白酶也有很大的關系。

圖4 不同發酵條件下鰱魚發酵過程中ANN的變化Fig.4 ANN changes in sliver carp during fermentation under different conditions

2.2.4 鰱魚發酵過程中硫代巴比妥酸（TBARS）的變化 TBARS是衡量脂肪氧化程度的指標之一。由圖5可知，發酵初期魚肉中TBARS值為0.24～0.26 mg/kg，隨著發酵時間的延長TBARS顯著增加，接種組中由于優勢菌種的作用，明顯低于對照組。添加混合發酵劑的兩組最高為2.322 mg/kg，而對照組最低為3.225 mg/kg，最高達到3.412 mg/kg，說明混合發酵劑明顯抑制TBARS的增長。在此發酵時間內，發酵魚肉中TBARS含量低于丙二醛限量值5 mg/kg[12]。

圖5 不同發酵條件下鰱魚發酵過程中TBARS的變化Fig.5 TBARS changes in sliver carp during fermentation under different conditions

2.3 不同發酵條件下揮發性風味成分的分析

魚肉發酵過程中產生的風味物質對魚肉產品的最終品質有重要影響。圖6表示了不同發酵條件下發酵鰱魚揮發性風味成分及其相對含量的變化。空白對照組 （A、B）分別檢測出風味化合物種類為31和41種；接種混合發酵劑組（C、D）分別檢測出揮發性風味化合物種類為65和65種。

圖6 不同發酵條件下發酵鰱魚的揮發性風味物質的變化Fig.6 Changesofvolatility in sliver carp during fermentation under different conditions

發酵過程中酵母菌對醇類化合物的生成貢獻最大；并且3%的鹽質量分數更有利于醇類的生成。另外，盡管醇類物質中3-甲基-1-丁醇、1-辛醇和1-壬醇含量相對較高，但由于其閾值較高，對風味的影響較小，而1-辛烯-3-醇因其較小的風味閾值且具有蘑菇香而對風味具有重要的貢獻。

碳氫化合物是所有揮發性風味成分中質量分數最多的物質，且各組之間的差距并不明顯，占到總揮發性風味物質的45%左右，但由于其閾值較高，因此其對風味的影響較小。

醛類物質由于較小的閾值對食品風味具有重要的貢獻。根據醛類的來源可將醛分為脂質氧化醛和氨基酸降解醛[13]。己醛、辛醛和壬醛等直鏈醛主要是不飽和脂肪酸的氧化產生，支鏈醛主要來自氨基酸降解。發酵鰱魚中的醛類化合物主要包3-甲基丁醛、庚醛、壬醛，其中支鏈醛3-甲基丁醛相對含量最高，對風味的貢獻較大[14]。

酮類形成主要來自于脂質的氧化和Strecker反應而發生的氨基酸降解。混合接種組（C、D）的酮類化合物明顯高于對照組，這可能是由于葡萄球菌促進酮類風味物質的生成。單個酮類物質中，變化最明顯的是2-甲基-3-辛酮。2-酮 （3，5-辛二烯-2-酮）由于具有特殊的香味[15]，因此被認為對肉產品風味具有重要作用。

酸、酯和芳香烴的揮發性化合物質量分數相對較低。接種混合發酵劑組（C、D）的酸類化合物質量分數 （6.38%～7.76%）明顯高于對照組 （2.69%～3.06%），這主要是由于魚肉發酵過程中乳酸菌產酸的原因。其中酸類化合物中乙酸質量分數相對較高。接種組的酯類質量分數分別為（3.6%～4.41%），高于對照組（3.09%～3.11%），說明接種微生物有利于酯類物質的生成。芳香烴中只檢測出一種呋喃（2-戊基呋喃），所占比例約為0.2%～0.7%，研究表明，2-戊基呋喃是由亞油酸和n-6脂肪酸衍生而來[16]，且由于閾值相對較低，因此對風味形成有重要貢獻。

3 結語

（1）魚肉混合接種發酵過程中乳酸菌快速生長，導致魚肉pH值48 h內降到4.5以下，有效抑制了魚肉中腸道菌、葡萄球菌和假單胞菌的生長繁殖以及TVBN和TBARS的積累。

（2）采用微生物混合接種發酵技術可改善魚肉風味，相較對照組，接種組中酯類、酮類和酸類香氣增加較為明顯；其中乙酸、己醇、1-辛烯-3-醇、3，5-辛二烯2-酮、3-甲基丁醛是主要的風味物質。

（3）在3%～5%的食鹽質量分數范圍內，鹽含量對發酵魚肉理化及風味品質沒有顯著影響。