明日葉中4-羥基德里辛和黃色當歸醇的提取純化及鑒定

王 磊， 張連富

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

明日葉（Angelica keiskei），是傘形科多年生草本植物，可藥食兩用[1]。嫩莖和葉可作為蔬菜用于炒、炸、涼拌或做湯，而全植物可入藥。研究表明，明日葉含有人體所需要的多種礦物質、氨基酸、維生素以及微量元素，是一種營養較全面、均衡的蔬菜[2]。此外明日葉還含有查爾酮類、香豆素類、類黃酮類、天然有機鍺等天然功能性成分[3]，具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖、改善睡眠、提高免疫力等保健功能[4]。均衡全面的營養以及優良的保健作用，賦予了明日葉很大的利用價值，以明日葉為原料開發出的產品也多種多樣，有保健茶[5]、保健酒[6]、固體飲料[7]、保健膠囊[8]、咀嚼片[9]、營養保健面條[10]、黑番茄醬[11]等。

其中 4-羥基德里辛（4-Hydroxyderricin，4-HD）和黃色當歸醇（Xanthoangelol，XAG）是明日葉中主要的功能性保健成分[12]。因此為了更好地開發和利用4-HD、XAG、明日葉及其相關的產品，需要對4-HD和 XAG進行深入的研究探討。然而，近年來對明日葉的研究主要集中在4-HD和XAG的功能保健作用上，明日葉中4-HD和XAG的提取工藝尚未見報道。因此本文以明日葉為原料，以4-HD和XAG的得率為評價指標，研究提取工藝參數（提取溶劑、溫度、時間、次數以及料液比）對提取得率的影響。在此基礎之上，采用正交試驗法優化提取工藝。此外，本文還采用硅膠柱層析和半制備高效液相分離純化得到高純度的4-HD和XAG，并通過液質聯用儀（HPLC-MS）及核磁共振儀（NMR）對 4-HD及XAG的分子結構及純度進行鑒定。為4-HD、XAG及明日葉的利用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明日葉根：江蘇百代蘭花股份有限公司；硅膠（200～300目）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；液相甲醇：色譜純，百靈威科技有限公司。

Waters1525液 相 色 譜 儀 （PDA檢 測 器Waters2998，自動進樣器 Waters2707）：美國 Waters公司；Aduance III 400 MHz核磁共振波譜儀：德國布魯克AXS有限公司；MALDI SYNAPT MS液相色譜串聯質譜聯用儀：美國Waters公司；Waters1525半制備高效液相色譜儀 （PDA檢測器Waters 2998和自動進樣器 Waters 2707）：美國 Waters公司；CHRIST冷凍干燥機 ALPHA1-2LD PLUS：德國Marin Christ公司；RV06-ML1B旋轉蒸發儀 （傾斜式）：德國 IKA。

1.2 4-HD和XAG含量的測定

1.2.1 混合標準溶液配置 精確稱取4-HD和XAG各5.0 mg，用甲醇溶解并定容于5 mL容量瓶中，得質量濃度為1 mg/mL的混合對照品儲備液。按梯度稀釋成質量濃度分別為 0.6、0.3、0.15、0.12、0.09、0.06及0.03 mg/mL的混合標準溶液。

1.2.2 HPLC色譜條件 色譜柱Phenomenex（C18，4.6 mm×l50 mm，5 μm）；柱溫 30 ℃；流動相甲醇∶水=8∶2；流速 1 mL/min，進樣量 20 μL；檢測波長330 nm[13]。

1.3 4-HD和XAG提取條件優化

1.3.1 原料的預處理 新鮮的明日葉根，清水洗滌，除去泥土等雜質，于50℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥，粉碎過60目篩，備用。

1.3.2 提取試劑的選擇 準確稱取5.0 g明日葉根粉于圓底燒瓶中，置于水浴鍋中提取，研究提取試劑（乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水）對4-HD和XAG提取得率的影響。

1.3.3 提取單因素試驗 準確稱取5.0 g明日葉根粉于圓底燒瓶中，置于水浴鍋中回流提取，研究乙醇體積分數、溫度、時間、料液比和提取次數對4-HD和XAG提取得率的影響。粗提液旋轉蒸發除去溶劑后，冷凍干燥。將凍干的粗提物用甲醇定容于250 mL的容量瓶中，HPLC分析，以4-HD和XAG的得率為評價指標，確定提取工藝條件。

1.3.4 正交試驗設計 以上討論了各單因素的影響，但實際操作中各因素相互交叉影響。根據單因素試驗結果，選取影響較大的水平進行正交試驗，以確定最佳提取條件。

采用 L9（34）正交表，以提取溫度（A）、乙醇體積分數（B）、料液比（C）、 提取時間（D）作為 4 個考察因素，選取其最佳條件范圍內的3個水平進行試驗。正交設計試驗因素水平見表1。

1.4 4-HD和XAG的純化

稱取明日葉根粉50 g，在最佳條件（料液比1∶10、80%乙醇、提取溫度55℃、提取時間90 min、提取2次）下進行試驗，收集粗提液，減壓濃縮得到深黃綠色浸膏。

表1 試驗設計因素水平表Table 1 Actors and levels of orthogonal test

往浸膏中加入200 mL去離子水，使其充分溶解，用2倍體積乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到萃取液浸膏。

浸膏用少量的洗脫劑 （正己烷∶乙酸乙酯=3∶7）溶解，上樣硅膠柱。調節硅膠柱層析的洗脫速度，使其每秒鐘流出1～2滴，每5 min接一管。流出液經HPLC-MS檢測，分別合并含有4-HD和XAG的組分流出液。減壓濃縮除去洗脫劑，得到硅膠柱層析樣品。

用半制備高效液相純化硅膠柱層析樣品。色譜條件如下：半制備 C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）；柱溫 30 ℃；流動相甲醇∶水=8∶2；流速 4 mL/min，進樣量1 mL；檢測波長330 nm。根據出峰情況分別收集相應組分的流出液。減壓濃縮除去甲醇后冷凍干燥。

1.5 4-HD和XAG的鑒定

對冷凍干燥的樣品進行HPLC-MS及NMR鑒定。其中 HPLC-MS的條件為 CSHC18（2.1mm×100mm，1.7 μm）；流動相甲醇∶水=8∶2；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL。質譜條件為離子方式：ESI；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流速：500 L/h；錐孔氣流速度：50 L/h；碰撞能量（eV）：6 V；質量范圍：100～1 500 m/z；檢測器電壓：1 800 V。樣品溶于CDCl3。四甲基硅烷作為化學位移標準品。

2 結果與分析

2.1 4-HD和XAG的混合標準曲線

根據HPLC結果可以得出4-HD和XAG的質量濃度X （μg/mL）與峰面積Y的線性關系擬合標準曲線公式分別為：Y=69 398.19X+136 486.68（R2=0.999 6）、Y=85 102.85X+138 820.79 （R2=0.999 1），線性范圍為0.03～1 mg/mL。混合標準品與樣品的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 混合標準品及明日葉根粗提液的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC analysis of mixed standard samples and crude extract sample solution

2.2 4-HD和XAG提取條件優化

2.2.1 提取試劑的選擇 試驗結果如圖2所示。從圖中看出，提取試劑對4-HD與XAG得率的影響是一致的。這可能是由于兩種物質具有相似的結構，相似的極性[14]。但不同溶劑對這兩種物質的提取效果差異顯著，乙醇和丙酮的效果較好，甲醇、乙酸乙酯、乙醚次之，水的提取效果最差。這可能是因為乙醇和丙酮的滲透性較大，且與4-HD與XAG的極性較相似，所以乙醇和丙酮的提取效果較好。但是丙酮毒性及揮發性較大，而乙醇較安全，故選擇乙醇作為提取溶劑。

圖2 提取試劑對4-HD和XAG得率的影響Fig.2 Effect of solvent on 4-HD and XAG yield

2.2.2 提取溫度對提取效果的影響 由圖3看出，隨著溫度上升，兩個物質得率逐漸增大，當溫度達到55℃時，這兩物質提取效果最佳。當溫度高于55℃時，這兩物質得率逐漸下降。4-HD和XAG的提取屬于固-液間進行物質傳遞的過程。體系的溫度會影響到原料微粒在溶劑中的運動特性。溫度低時溶劑分子運動慢，不能很好地溶解出4-HD和XAG，溫度升高4-HD和XAG溶出量增加，提取量增大；但對4-HD和XAG的穩定性研究表明，當環境溫度過高時，4-HD和XAG等查爾酮化合物會不可避免地降解[15]。當兩者的作用達到平衡時提取量將不再增加，但當后者的作用占主導地位時提取量就會降低。故提取溫度應選擇55℃左右為宜。

圖3 提取溫度對4-HD和XAG得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on 4-HD and XAG yield

2.2.3 乙醇體積分數對提取效果的影響 由圖4可知，以乙醇為提取溶劑，體積分數在60%～80%范圍內，得率隨乙醇體積分數的增加而增大，80%乙醇溶液的提取效果最好。80%～100%范圍內，得率隨乙醇體積分數的增加而減小。4-HD和XAG均含有酚羥基，在植物體內會與蛋白質、多糖等以氫鍵及疏水鍵形式結合，而有機試劑具有斷裂氫鍵的作用。但是純的有機試劑不足以破壞氫鍵，故可采用有機試劑和水的復合體系作為提取溶劑。但是4-HD和XAG的極性較低，由“相似相溶”原理知，當提取劑中水的比例過高，使得提取劑極性偏大時，得率會下降。所以乙醇體積分數應選擇80%左右為宜。

2.2.4 料液比對提取效果的影響 料液比增大，傳質動力增加，使原料中更多目標物質進入到溶液中[16]。當浸提劑用量增加到一定程度，傳質達到平衡后，再增加溶劑用量，4-HD和XAG的溶出總量不再增加，而僅僅是更加均勻地分布在溶劑中。考慮到成本，料液比應選擇1∶10左右為宜（圖5）。

圖4 乙醇體積分數對4-HD和XAG提取效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on 4-HD and XAG yield

圖5 料液比對4-HD和XAG提取效果的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on 4-HD and XAG yield

2.2.5 提取時間對提取效果的影響 由圖6可知，隨著提取時間的延長，得率先增高，后略微下降。在90 min時，兩物質得率達到最大。提取的傳質過程要有足夠的時間達到平衡，時間太短，提取還沒有達到平衡，提取量就較低；但是如果提取時間過長，4-HD和XAG在較高溫長時間作用下會受到破壞。故提取時間應選擇90 min左右為宜。

圖6 提取時間對4-HD和XAG提取效果的影響Fig.6 Effect of extraction time on 4-HD and XAG yield

2.2.6 提取次數對提取效果的影響 從圖7可以看出，對4-HD第1次和第2次提取量分別占總提取量的75.21%和22.87%，第3次及第4次提取量分別占總提取量的1.69%和0.23%。對XAG第1次和第2次提取量分別占總提取量的77.80%和19.81%，第3次及第4次提取量分別占總提取量的1.78%和0.61%。總的來說，4-HD和XAG前兩次的提取量分別已達到總提取量的98.08%及97.61%。提取的次數越多，目標產物得率也越多，但同時提取劑消耗量也越多。故提取次數應選擇提取2次為宜。

圖7 提取次數對4-HD和XAG提取效果的影響Fig.7 Effect of times of extraction on 4-HD and XAG yield

2.2.7 正交試驗結果與分析 由單因素試驗得，各因素對4-HD與XAG得率的影響是一致的，所以為了方便，在正交試驗中只需考察各因素對4-HD得率的影響情況。正交試驗設計及結果如表2所示。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal test and results

根據表2中K值可知，最佳提取工藝為A2B2C1D2，即提取溫度55℃，乙醇體積分數80%，料液比1∶10，提取時間90 min。由極差R的大小，可判斷出影響得率的因素順序依次為B＞A＞D＞C，即乙醇體積分數＞提取溫度＞提取時間＞料液比。

2.2.8 驗證試驗 按提取溫度55℃，80%乙醇，料液比 1∶10，提取時間90 min，提取2次進行3次平行試驗，4-HD得率均值為1.82 mg/g，XAG得率均值為2.12 mg/g，高于表2每一項試驗結果，故A2B2C1D2為最佳提取工藝。

2.3 4-HD和XAG的純化

50 g明日葉根粉在最優條件下提取，粗提液冷凍干燥得到13.79 g粗提物，經測定，其中含有91 mg 4-HD、106 mg XAG。考慮到4-HD和XAG極性較低，經乙酸乙酯萃取可進入到乙酸乙酯相中[13]，籍此可以初步除去極性較強的雜質，如類黃酮、極性色素、多糖、無機離子等。減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到1.03 g萃取物。經萃取后，4-HD的純度由粗提取中的0.66%提高到8.83%；XAG的純度由0.77%提高到10.29%。

萃取物過硅膠柱層析，經洗脫劑（正己烷∶乙酸乙酯=3∶7）洗脫，用HPLC-MS檢測各收集管4-HD和XAG。結果表明，34-41管主要含有4-HD，50-75管主要含有XAG組分（如圖8所示），純度分別為70.63%和67.94%。合并洗脫組分，濃縮除去洗脫劑，得到硅膠柱層析樣品。

圖8 萃取物經硅膠柱層析洗脫HPLC譜圖Fig.8 HPLC analysis of different fractions purified by silica gel column chromatography

硅膠柱層析樣品用半制備高效液相進行純化。根據出峰情況分別收集相應組分的流出液，分別在22.306和 28.202 min收集到化合物1和化合物2。減壓濃縮除去收集液中的甲醇后冷凍干燥。

2.4 4-HD和XAG的鑒定

對用制備型高效液相純化得到的化合物1和化合物2進行HPLC-MS及NMR結構及純度鑒定。質譜圖如圖9所示。

圖9 化合物1和化合物2的ESI-MS圖譜Fig.9 Results of ESI-MS chromatogram of compound 1 and 2

化合物 1質譜數據（圖 9（a）），碎片 m/z 337.152 8是[M-H]-分子離子峰，338.1613是母離子峰，所以其分子量為338。化合物2質譜數據（圖9（b）），碎片m/z 391.199 8是[M-H]-分子離子峰，392.205 7是母離子峰，所以化合物2的分子質量為392。

化合物 1 的 NMR 數據：1H-NMR δ1.71（3H，s，H-5″），1.82 （3H，s，H-4″），3.41 （2H，d，3J（H，H） =7.13 Hz，H-1″），3.93 （3H，s，4′-OCH3），5.26（1H，m，3J（H，H） =7.16 Hz，H-2″），6.52（1H，d，3J（H，H） =9.12 Hz，H-5′） 6.90（2H，d，3J（H，H） =8.44 Hz，H-3，5），7.48（1H，d，3J（H，H） =15.45 Hz，H-α），7.56（2H，d，3J （H，H） =8.35 Hz，H-2，6），7.81（1H，d，3J（H，H） =9.29 Hz，H-6′），7.84（1H，d，3J（H，H）=16.60 Hz，H-β），13.48 （1H，s，2′-OH）。13C-NMR δ 17.84 （C-4″），21.75 （C-1″） 25.81 （C-5″），55.80（OCH3），102.21（C-5′），114.67（C-1′），116.08（C-3，5），117.62（C-3′），118.08（C-α），122.05（C-4′），127.63（C-1），129.25（C-5′），130.58（C-3″），131.97（C-2，6），144.19 （C-β），158.24 （C-4），162.99 （C-2′），163.35（C-4′），192.53（C=O）。

化合物 2 的 NMR 數據：1H-NMR δ1.59（3H，s，H-9″），1.67（3H，s，H-8″），1.83（3H，s，H-10″），2.10（4H，m，H-4″，5″），3.49（2H，d，3J（H，H） =7.14 Hz，H-1″），5.06（1H，t，3J（H，H）=6.09 Hz，H-6″），5.30（1H，dd，3J （H，H） =7.20 Hz，H-2″），6.43（1H，d，3J（H，H） =8.90 Hz，H-5′），6.88 （2H，d，3J （H，H） =8.46 Hz，H-3，5），7.46（1H，d，3J（H，H） =15.44 Hz，H-α），7.57（1H，d，3J（H，H）=8.58 Hz，H-2，6），7.57（1H，d，3J （H，H） =8.90 Hz，H-6′），7.86（1H，d，3J（H，H）=15.37 Hz，H-β），13.88（1H，s，2′-OH）.13CNMR δ 16.31（C-10″），17.70（C-9″），21.81（C-1″），25.63（C-8″），26.48（C-5″），39.77（C-4″），114.20（C-1′，3′），116.11（C-3，5），118.38（C-α），121.11（C-2″），123.83 （C-6″），127.99 （C-1），129.29 （C-6′），130.56 （C-2，6），132.07 （C-7″），139.73 （C-3″），144.09（C-β），158.08（C-4），161.86（C-4′），163.95（C-2′），192.36（C=O）。

所以由此確定化合物1和化合物2的分子分別為C21H22O4、C25H28O4。結構式見圖10。即化合物1為4-HD，化合物2為XAG。

圖10 化合物1和化合物2的結構式Fig.10 Chemical structures of compound 1 and 2

3 結 語

本文以明日葉為原料，首次對4-羥基德里辛和黃色當歸醇的提取工藝進行探討。通過單因素以及正交試驗得出4-羥基德里辛和黃色當歸醇最佳提取工藝，條件為：提取次數2次、提取溶劑80%乙醇、提取溫度55℃、提取時間90 min、料液比 1∶10。在此條件下，4-HD得率為1.82 mg/g，XAG得率為2.12 mg/g。這為明日葉以及4-羥基德里辛和黃色當歸醇的利用奠定了基礎。采用乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析以及半制備液相相結合的方法對粗提液進行純化，經HPLC-MS及NMR分析表明，純化得到的兩種物質為4-羥基德里辛和黃色當歸醇，純度分別為99.08%和98.92%。