高強度聚焦超聲對宮頸癌大鼠免疫功能及生存時間的影響

黃 敏，彭月享，高衛元，黃紅麗

(1.武漢市第三醫院光谷院區 超聲科，武漢 430000； 2.武漢市第三醫院光谷院區 婦產科，武漢 430000)

宮頸癌早期常無明顯癥狀和體征，主要采用外科手術治療，中晚期主要表現為不規則陰道流血、陰道排液等，嚴重者可表現為貧血、惡病質等全身衰竭癥狀，主要采用放射治療或化療，但其治療效果并不十分令人滿意[1]。高強度聚焦超聲治療(high intensity focused ultrasound，HIFU)是近年來發現的一種新型的腫瘤治療方法，利用高強度超聲波聚焦后，穿透到人體內，殺滅靶區內的腫瘤細胞，還可能激活機體的免疫系統，提高患者的免疫功能，從而達到治療腫瘤的目的[2]。已有研究顯示，HIFU可以用于臨床晚期胰腺癌[3]、子宮肌瘤[4]、宮頸癌[5]等的治療，延長患者的生存期，且毒副反應小。但HIFU治療宮頸癌研究報道較少，殺滅腫瘤細胞的機理尚不明確，對宮頸癌患者免疫功能的影響亦尚不清楚。因此，本研究探索了HIFU對宮頸癌大鼠免疫功能和生存時間的影響，旨在為HIFU在宮頸癌治療中的應用提供一定的理論支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60只6～8周齡Wistar大鼠，清潔級雌性，體重均為160～200 g，由湖北省實驗動物研究中心提供[SCXK(鄂)2015-0018]，經武漢市第三醫院倫理委員會批準(20170119-03)，飼養于本院動物中心實驗室[SYXK(鄂)2019-0080]，保持室溫恒定為25℃，模擬晝夜光照，自由攝食與飲水，嚴格按實驗動物3R原則給予實驗動物人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

FACSCanto II流式細胞儀購自美國BD公司；全自動酶標儀購自Thermo Scientific公司；人宮頸癌HeLa細胞由上海鈺博生物科技有限公司提供，接種于含有100 U/mL青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，于37℃、5% CO2培養箱中培養。MTT檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海一研生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模與給藥

大鼠預飼養7 d后，隨機分為對照組、模型組和HIFU組，每組20只，每組隨機選取10只用于觀察大鼠的生存時間和體重變化，剩余10只用于病理、免疫相關指標的檢測。模型組和HIFU組采用左側腋窩處皮下注射人宮頸癌HeLa細胞建立宮頸癌大鼠模型[6]，均經左側腋窩處皮下注射接種人宮頸癌HeLa細胞(0.5 mL，1×107/mL)，密切觀察，肉眼可見大鼠左腋窩處有明顯腫瘤結節生長即為造模成功，對照組于左側腋窩處皮下注射等體積生理鹽水。造模后第7天，HIFU組進行局部HIFU治療，輻照強度為2.3 MPa，單點單次治療時間為10 s，共250 s，對照組和模型組治療程序與HIFU治療相同，但功率源開關關閉。對照組、模型組和HIFU組20只大鼠中，10只用于觀察大鼠的生存時間和體重變化，于造模之日開始觀察，觀察時間共9周；剩余10只大鼠于治療后14 d立即處死，分離大鼠的血液，無菌剝離移植瘤組織，分離大鼠脾，用于病理及免疫相關指標的檢測。

1.3.2 觀察各組大鼠的生存時間

于造模之日開始觀察大鼠的生存狀態，記錄各組大鼠9周內的生存狀態(生存或死亡)，分別于造模前、造模后1周給藥即刻、造模3周、造模5周和造模7周稱取大鼠的體重。

1.3.3 觀察各組大鼠的移植瘤體積和重量

處死大鼠后，剝離大鼠移植瘤組織，測移植瘤長徑、短徑，計算其腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2，同時稱取移植瘤重量，計算HIFU的抑瘤率=(1-實驗組腫瘤組織重量/對照組腫瘤組織重量)×100%。

1.3.4 HE染色觀察大鼠移植瘤組織病理變化

采集大鼠移植瘤組織，進行常規切片制作和HE染色，顯微鏡下觀察移植瘤組織的病理變化。

1.3.5 MTT檢測脾淋巴細胞活力

取各組大鼠脾組織，剪碎研磨，過濾，離心(1500 r/min，10 min)，棄上清，加入10 mL氯化銨37℃水浴10 min，加入2 mL的RPMI 1640培養液中進行培養，采用臺盼藍染色，計數活細胞在95%以上，制備成脾淋巴細胞液。將脾淋巴細胞懸液以每毫升1×105個接種于96孔培養板，在37℃、5% CO2條件下培養，分別于0 h、24 h、48 h、72 h，進行MTT檢測，酶標儀測定波長為570 nm處的吸光度值(OD570)，繪制細胞生長曲線，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.3.6 流式細胞儀分析外周血T淋巴細胞亞群

分離腹主動脈血液，抗凝離心(3000 r/min，5 min)，棄上清，室溫避光孵育30 min，加紅細胞裂解液作用15 min，加70%乙醇混合，4℃靜置48 h，棄上清，采用1 mL PBS 重懸，加入5 μL濃度為10 mg/mL的RNase，37℃下孵育1 h，分別加入相應的流式抗體(CD4-APC，CD8-PE)，室溫避光孵育30 min，上機流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T細胞比例。

1.3.7 流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞凋亡

分離腹主動脈血液，抗凝離心(3000 r/min，5 min)，采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，PBS重懸后，收集各組細胞，采用不含EDTA的胰蛋白酶進行消化，離心(3000 r/min，5min)，用冷PBS洗滌，以每毫升1×105個接種于6孔板，采用Annexin V-FITC/PI試劑盒染色，上機流式細胞儀檢測細胞凋亡，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 HIFU對各組大鼠生存時間的影響

生存分析結果顯示，模型組大鼠于造模后43 d開始出現死亡，HIFU組大鼠于造模后46 d開始出現死亡；與模型組相比，HIFU組的中位生存時間明顯延長[(54.51±3.16) vs (48.03±1.05)，Log Rank χ2=7.504，P=0.006]，見圖1。

圖1 各組大鼠的生存曲線比較Figure 1 Comparison of survival curves of rats in each group

2.2 HIFU對各組大鼠體重的影響

造模前各組大鼠的體重均無明顯差異(P>0.05)；與對照組相比，模型組和HIFU組大鼠造模3周、5周和7周時大鼠體重均明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，HIFU組大鼠造模3周、5周和7周時大鼠體重均明顯升高(P<0.05)，見表1。

2.3 HIFU對各組大鼠移植瘤體積和重量的影響

與模型組相比，HIFU組的腫瘤體積和重量明顯降低(P<0.05)，HIFU的抑瘤率為35.25%，見表2。

2.4 各組大鼠移植瘤組織的病理變化

HE染色結果顯示，模型組大鼠移植瘤組織細胞呈橢圓形，胞核呈兩個或多個，結構和細胞形態未見異常；HIFU組大鼠移植瘤組織細胞皺縮、核染色質固縮，出現片狀壞死區，見圖2。

2.5 HIFU對各組大鼠脾淋巴細胞活力的影響

MTT實驗結果顯示，與對照組相比，模型組和HIFU組脾淋巴細胞活力明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，HIFU組脾淋巴細胞活力明顯升高(P<0.05)，見圖3。

2.6 HIFU對各組大鼠外周血中CD4+和CD8+ T細胞水平的影響

流式細胞分析結果顯示，與對照組相比，模型組和HIFU組外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞和CD4+/CD8+T細胞比值均明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，HIFU組外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞和CD4+/CD8+T細胞比值均明顯升高(P<0.05)，見表3。

2.7 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴細胞凋亡的影響

流式細胞分析結果顯示，與對照組相比，模型組和HIFU組T淋巴細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，HIFU組T淋巴細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，見圖4、表4。

表1 HIFU對各組大鼠體重的影響Table 1 Effect of HIFU on body weight of rats in each group

表2 各組大鼠移植瘤的體積和重量Table 2 Volume and weight of transplanted tumor in each group

圖2 各組大鼠移植瘤組織的病理變化(HE染色)Figure 2 Pathological changes of transplanted tumor tissues in each group of rats (HE staining)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖3 HIFU對各組大鼠脾淋巴細胞活力的影響Note. Compared with control group,*P < 0.05. Compared with model group,#P < 0.05.Figure 3 Effect of HIFU on spleen lymphocyte activity in each group

表3 各組大鼠外周血中CD4+和CD8+ T 細胞水平

圖4 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴 細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of HIFU on T lymphocyte apoptosis in peripheral blood of rats in each group

表4 HIFU對各組大鼠外周血中T淋巴細胞凋亡的

3 討論

宮頸癌是常見的女性三大惡性腫瘤之一，臨床主要采用外科手術聯合放化療，預后較差[7]。HIFU是一種新型的非侵入性治療手段，可以將超聲波進行聚焦后，安全地將能量密度較低的超聲波匯聚至靶區，利用焦點處超聲波的熱效應，使靶區組織細胞發生不可逆的損傷，達到抗腫瘤的作用[8]。目前，HIFU已被用于前列腺癌、乳腺癌、軟組織腫瘤以及子宮腺肌癥等多種疾病的治療[9]，但對宮頸癌的作用研究報道較少。因此，本研究分析了HIFU對宮頸癌大鼠生存時間的影響。本研究中，HIFU作用后可明顯延長宮頸癌大鼠的生存時間，提示HIFU可能通過抗腫瘤作用，延長大鼠的生存時間。許濤等[10]的研究顯示，HIFU可用于晚期宮頸癌患者的治療，減少局部復發，提示HIFU對宮頸癌具有的一定的抗腫瘤作用，有望應用于臨床。本研究中，HIFU作用后可明顯改善宮頸癌大鼠的體重，誘導腫瘤組織壞死，減少移植瘤體積和重量。Hectors等[11]的研究顯示，HIFU可以將超聲波能量匯聚于腫瘤組織，通過熱效應，使腫瘤細胞發生凝固性壞死，提示HIFU可能通過破壞宮頸癌腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞壞死，發揮其抗腫瘤作用，延長大鼠的生存時間。

細胞免疫是機體抗腫瘤的主要機制，腫瘤細胞可通過改變細胞表面抗原、降低或不表達組織相容性抗原Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)和MHC-Ⅱ、分泌多種免疫抑制因子等多種途徑，發生免疫逃避或免疫抑制，發生惡性增殖[12]。本研究中，宮頸癌大鼠的脾淋巴細胞活力明顯下降，HIFU作用后可明顯提高大鼠的脾淋巴細胞活力。脾是機體最大免疫系統中的最主要的免疫器官之一，含有大量淋巴細胞和巨噬細胞，可以清除血細胞抗原和異物，是機體免疫系統的中心，脾淋巴細胞增殖活性可以反應機體淋巴細胞的功能[13]。許濤等[14]的研究顯示，HIFU可以改善原發性肝癌的免疫功能，延長患者的生存時間，提示HIFU可能通過誘導腫瘤細胞壞死，抑制腫瘤細胞分泌的免疫抑制因子，提高脾淋巴細胞活力，提高機體的細胞免疫功能和抗腫瘤能力，從而延長宮頸癌大鼠的生存時間。

本研究中，宮頸癌大鼠的外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞和CD4+/CD8+T細胞比值均明顯下降，HIFU作用后可明顯提高大鼠外周血。T淋巴細胞亞群是機體抗腫瘤免疫的主要免疫細胞，按功能可分為輔助T細胞(T helper cells，Th)、記憶T細胞、細胞毒性T細胞(Cytotoxic T cells，Tc)、調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)和抑制性T細胞(suppressor T cell，Ts)[15]。CD4+T 細胞主要為Th細胞，CD4分子主要與MHC-Ⅱ分子相結合，CD8分布于Tc細胞及Ts細胞表面，可以與MHC-Ⅰ分子結合，共同調節細胞的免疫功能[16]。Th細胞可以分泌多種細胞因子，促進其他T細胞的分化成熟，在協助誘導細胞免疫中具有重要作用，還可以輔助B細胞分化為抗體分泌細胞，協助B細胞產生抗體，Tc細胞主要通過分泌各種細胞因子參與免疫作用，清除病毒、腫瘤等靶細胞，Ts細胞則能抑制Th細胞，負向調節細胞的免疫功能[17-18]。已有研究顯示[19]，CD4+T/CD8+T細胞比值可反映機體的整體免疫功能，提示HIFU作用后，可明顯改善宮頸癌大鼠降低的免疫功能。本研究中，宮頸癌大鼠的外周血T淋巴細胞凋亡率明顯升高，HIFU作用后可明顯降低T淋巴細胞凋亡率。已有研究顯示[20]，腫瘤細胞可通過誘導T淋巴細胞凋亡，發生免疫逃避或免疫抑制，進行惡性增殖，提示HIFU作用可能通過破壞宮頸癌腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞誘導的T淋巴細胞凋亡，改善機體的免疫功能，抑制腫瘤細胞的免疫逃避或免疫抑制，提高其抗腫瘤作用。

綜上所述，HIFU可以明顯升高大鼠的CD4+T細胞、CD8+T的數量以及CD4+/CD8+T細胞比值，提高脾淋巴細胞活力，改善大鼠降低的免疫功能，延長宮頸癌大鼠的生存時間，但HIFU調節機體免疫功能的具體機制尚不明確，需進一步深入研究探索。