遠志皂苷元對脂多糖誘發神經細胞炎癥損傷的保護作用

皮 婷，梁月琴，歐雯勵蓉，朱 晗，陶彥林，金醒昉*

(1.昆明醫科大學附屬延安醫院，昆明 650051； 2.中南大學湘雅醫學院，長沙 410013； 3.上海中醫藥大學中藥研究所，上海 201203)

據全國腫瘤登記中心，最新的腫瘤登記年報顯示中國新發惡性腫瘤發病約392.9萬人，死亡約233.8萬人。平均每天超過1萬人被確認為癌癥，每分鐘有7.5個人被確證為癌癥。隨著惡性腫瘤發病率的增高，化療藥物所扮演的角色也越來越重要，同時這些藥物所引起的近期或遠期的不良反應也日漸受到關注。最早是在接受化療后的乳腺癌患者中發現，很多幸存者都出現記憶力下降等認知功能障礙，被稱為“化療腦”(chemo-brain)。近幾年體內外大量研究表明，長期使用化療藥物后可導致患者出現“化療腦”：即化療相關性認知功能障礙，是癌癥患者在化療后出現的記憶力、學習力、注意力、推理能力、執行功能、信息加工速度和視覺空間功能等認知功能的損害[1-4]。而有研究認為“化療腦”主要是由于少量化療藥物或炎癥反應細胞因子等透過血腦屏障，多因素作用后，造成中樞神經毒性，導致神經元損傷甚至神經再生障礙[5-6]。由此可知，炎癥因子在“化療腦”的發生發展中起到了舉足輕重的作用，且炎癥細胞因子級聯反應所引起的神經損傷是“化療腦”發生的關鍵因素。

學者們發現神經營養因子或神經保護因子，如神經生長因子(neurogrowthfactor, NGF)[7-8]、胰島素樣生長因子-1 (insulin-like growth factor-1, IGF1)[9]、促紅細胞生成素[10-11]、白血病抑制因子(leukaemia factor, LIF)[12]等，可一定程度的減緩神經病變，改善“化療腦”。然而，由于它們的分子量大難以透過血腦屏障、穩定性差、或對人體有害副作用等等，限制了其臨床應用。

遠志為常用藥用植物，《神農本草經》記載：主咳逆傷中，補不足，除邪氣，利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強志倍力。富含皂苷類、寡聚糖類、口山酮類化合物，具有提高記憶、改善認知等藥理作用[13-15]。遠志皂苷元為遠志皂苷水解產物，為齊墩果烷型三萜，我們前期研究發現遠志皂苷元可促進皮質神經元存活，促進神經元突起生長，具有類似神經營養因子作用[16-18]。但遠志皂苷元對神經細胞炎癥損傷方面的影響研究較少。

為了探討遠志皂苷元對神經細胞的炎癥損傷是否具有保護作用，本文以脂多糖作用小神經膠質細胞BV2誘導神經炎癥損傷模型，通過觀察炎癥因子及炎癥相關蛋白的表達，來探究具有神經營養作用的小分子中藥單體—遠志皂苷元對神經細胞炎癥損傷的保護作用，為進一步研究“化療腦”的防治提供新思路及新方向。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

本研究中涉及細胞人多巴胺能神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y由中科院細胞庫提供；小鼠小膠質細胞BV2購自ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

遠志皂苷元，購自北京索萊寶科技有限公司，含量>99.0%，實驗時用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)配置成相應濃度, 4℃保存； 地塞米松(dexamethasone，Dex)(M0606AS)購自大連美侖生物技術有限公司；胰蛋白酶(美國Amresco公司); DMEM (美國Gibco公司); 胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司); 磺胺(S9251)，鹽酸萘乙二胺(N9125)均購自美國Sigma公司；COX-2引物(mus-cox2-F:CTGAGTGGGGT GATGAGCAA;mus-cox2-R:GAGGCAATGCGGT TCTGATAC)購自上海捷瑞生物工程有限公司; 兔抗人COX-2單克隆抗體(12282)購自美國CST公司; GAPDH(GAPDH-F-5’ATGTGTCCGTCGTGGATC TGA3’;GAPDH-R-5’ATGCCTGCTTCACCACCTTCT3’)購自上海捷瑞生物工程有限公司；其余試劑均為國產分析純。12 孔板、96 孔板(美國Corning 公司產品)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；培養箱(英國GalaxyS公司)； 倒置顯微鏡(日本lympus公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 神經細胞的制備和培養

小膠質細胞BV2細胞用DMEM/FBS+1% PS的培養液，在5% CO2、37℃濕飽和條件下培養。細胞生長至80% 融合度時，以0.25%的胰酶消化后按1瓶傳至3瓶進行傳代，取其對數生長期細胞進行實驗。

人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y用DMEM/FBS + 1% PS的培養液，在5% CO2、37℃濕飽和條件下培養。細胞生長至80%融合度時，以0.25%的胰酶消化后按1瓶傳至4瓶進行傳代，取其對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2 炎癥介質NO濃度檢測

調整BV2細胞濃度為每毫升1.5×106個，種于96孔板中過夜，預給藥遠志皂苷元后2 h，加入LPS(終濃度200 ng/mL)，分為：空白對照組，LPS組，地塞米松組及遠志皂苷元各濃度組。繼續培養22 h后，利用Griess Reagent法檢測炎癥介質NO濃度。于超凈臺內分別每孔吸80 μL上清液到新的96孔板中，同時制作NaNO2標準曲線(200、100、50、25、12.5、0 μmol/L)，每個濃度設置2個副孔，避光下加入80 μL預先配置好的Greiss試劑(A液∶B液=1∶1)，混勻后于培養箱中孵育15 min，利用酶標儀在540 nm處測定吸光度值。繪制NaNO2標準曲線，將吸光度值帶入標準曲線中計算NO含量。

調整SH-SY5Y細胞濃度為每毫升1.6×106個，種于96孔板中過夜，加入遠志皂苷元作用于LPS誘發BV2細胞炎癥的上清刺激細胞，培養24 h。然后利用通過上述 Griess Reagent 法檢測NO 濃度。

1.3.3 兔抗人環氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX2)表達水平檢測

調整BV2細胞濃度為每毫升1.5×106個/mL，種于12孔板中過夜。分為：空白對照組，LPS組，地塞米松組及遠志皂苷元(2 μmol/L、2.5 μmol/L、3 μmol/L)低、中、高劑量組，預給藥低、中、高劑量遠志皂苷元后2 h，加入LPS(終濃度終濃度200 ng/mL)，再繼續培養22 h后，1000 r/min離心5 min，收集細胞，QPCR法檢測COX-2 mRNA(mus-cox2-F：CTGAGTGGGGTGATGAGCAA；mus-cox2-R：GAGGCAATGCGGTTCTGATAC)表達水平，Western blot法檢測COX-2蛋白表達水平。

1.3.4 QPCR法檢測COX-2 mRNA表達

實驗分組如前所述，各組細胞均于藥物干預 24 h 后提取RNA。按試劑盒說明書進行總RNA的提取、逆轉錄成cDNA，再進行 PCR 擴增。PCR反應體系總體積為18 μL。反應條件如下：95℃預變性5 min， 繼之95℃變性10 s，60℃退火30 s，95℃ 延15 s，共42個循環。計算結果用GAPDH標化目的基因的相對表達，通過2-ΔΔCt定量目的基因。

1.3.5 Western blot 印跡法檢測COX-2蛋白表達

實驗分組如前所述。各組細胞均于藥物干預 24 h 后提取細胞蛋白。上樣前先將制備好的蛋白樣品95℃煮5 min，冷卻后瞬時離心，待用。取變性后的各組細胞蛋白等量上樣到SDS聚丙烯酰胺凝膠，電泳結束后將膠上的蛋白轉移到PVDF膜，100 V轉模2 h后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1.5 h，孵育相應的一抗4℃過夜，次日用PBST室溫下洗滌3次，每次10 min。然后據一抗的抗性選擇相同抗性的二抗(稀釋比例為1∶5000)進行室溫下孵育1 h，用PBST洗滌3次，每次10 min。再據底物試劑盒要求顯影、拍照，并保存圖像。運用TanonImage軟件進行目的蛋白灰度分析。

1.3.6 細胞活力檢測

調整SH-SY5Y細胞濃度為每毫升1.6×106個，種于96孔板中過夜。分為：空白對照組(不做任何處理)，對照組(除遠志皂苷元外，其余均加入)，LPS組，地塞米松組及遠志皂苷元低、中、高劑量組。SH-SY5Y細胞貼壁后，棄上清換用LPS誘發小膠質細胞BV2炎癥的上清1 mL，并加入遠志皂苷元(2 μmol/L、2.5 μmol/L、3 μmol/L)繼續培養24 h后，加入 CCK-8孵育 0.5 h，采用波長450 nm 測定吸光值。

注：與LPS組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖1 不同濃度遠志皂苷元對LPS誘導的BV2細胞NO釋放量的影響Note. Compared with the LPS group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Table 1 Effects of different concentrations of senegenin on the release of NO in LPS-induced BV2 cells

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度的遠志皂苷元對LPS誘發小膠質細胞BV2產生NO的影響

因前期研究發現[16-18]2 μmol/L遠志皂苷元具有較好的神經營養作用，故在BV2細胞上摸索遠志皂苷元的抗炎有效濃度時，設計了1、2、4、8 μmol/L，5、25、50、100 μmol/L兩個梯度。如圖1A-C所示，圖1A是從1、2、4、8 μmol/L的遠志皂苷元，結果顯示1、2 μmol/L兩個濃度的遠志皂苷元有抗炎作用(P< 0.01或P< 0.05)；圖1B是從5、25、50、100 μmol/L的遠志皂苷元，結果顯示均無抗炎作用，還具有促炎作用，且呈濃度依賴性；根據以上結果縮窄遠志皂苷元的濃度，圖1C是1.5、2、2.5、3、3.5 μmol/L 的遠志皂苷元，結果顯示這些濃度下的遠志皂苷元均有抗炎作用(P<0.01或P<0.05或P<0.001)，且以2 μmol/L的遠志皂苷元抗炎作用最為明顯。

2.2 遠志皂苷元對LPS誘導的BV2細胞COX-2 mRNA表達的影響

根據以上結果選取2、2.5、3 μmol/L(低、中、高)劑量遠志皂苷元作用的細胞進行COX-2 mRNA表達的檢測，結果如圖2所示，LPS作用后的BV2細胞COX-2 mRNA顯著升高(P<0.001)，陽性藥地塞米松組和LPS組相比顯著降低(P<0.001)，2、2.5 μmol/L的遠志皂苷元組和LPS組相比也顯著降低(P<0.001)。

2.3 遠志皂苷元對LPS誘導的BV2細胞COX-2蛋白表達的影響

Western blot 檢測低、中、高劑量組遠志皂苷元COX-2 蛋白的表達情況。結果如圖3所示，LPS作用后的BV2細胞中COX-2 蛋白表達顯著升高(P< 0.001)，與LPS組相比，陽性藥地塞米松組COX-2 蛋白表達顯著降低(P<0.001)，雖2 μmol/L遠志皂苷元組COX-2 蛋白表達量高于陽性對照組，但相比LPS組也有較明顯的降低(P< 0.05)。

2.4 遠志皂苷元對SH-SY5Y接受BV2炎癥上清刺激后的細胞活力影響

該部分實驗主要是研究遠志皂苷元對SH-SY5Y接受BV2炎癥上清刺激后的炎癥影響，需加入前部分實驗中LPS誘導BV2細胞炎癥后的上清，所以該部分實驗分了兩個實驗對照 (Ctrl) 組，一個對照組不加BV2細胞炎癥上清，另一個對照加入該上清。這樣更好的排除了其他因素對結果的影響，增加該實驗結果的說服力，確保該部分實驗中遠志皂苷元為主要實驗變量，明確遠志皂苷元在該部分實驗中的作用。

如圖4所示，SH-SY5Y接受BV2炎癥上清刺激后，LPS刺激BV2上清組的細胞活力和對照組相比顯著下降(P<0.05)，給2.5、3 μmol/L 遠志皂苷元BV2上清可以保護SH-SY5Y細胞活力免遭LPS的影響(P<0.05或P<0.01)。

注：與LPS組比較， **P<0.01，***P<0.001。圖2 遠志皂苷元對LPS誘導的BV2細胞COX-2 mRNA 表達水平的影響Note. Compared with the LPS group, **P<0.01，***P<0.001.Table 2 Effect of senegenin on the expression level of coX-2 mRNA in LPS-induced BV2 cells

注：A: WB條帶；B：灰度值比較。與LPS組比較， *P<0.01，****P<0.001。圖3 遠志皂苷元對LPS誘導的BV2細胞COX-2 蛋白表達水平的影響Note. A, WB strip. B, Gray value comparison. Compared with the LPS group, *P<0.01，****P<0.001.Table 3 Effect of senegenin on the expression level of COX-2 protein in LPS-induced BV2 cells

注：與LPS組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。圖4 遠志皂苷元對SH-SY5Y接受BV2炎癥 上清刺激后細胞活力的影響Note. Compared with the LPS group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Table 4 Effects of senegenin on cell viability of SH-SY5Y after BV2 supernatant stimulation

注：與LPS組比較，***P<0.001。圖5 遠志皂苷元對SH-SY5Y接受BV2炎癥上清 刺激后NO釋放量的影響Note. Compared with the LPS group, ***P<0.001.Table 5 Effects of senegenin on the release of NO after SH-SY5Y received BV2 supernatant stimulation

2.5 遠志皂苷元對SH-SY5Y接受BV2炎癥上清刺激后的細胞產生NO影響

如圖5所示，實驗分組與上述分組情況一樣。SH-SY5Y接受BV2炎癥上清刺激后，LPS刺激BV2上清組的SH-SY5Y細胞分泌NO和空白對照組相比顯著上升(P<0.001)；相比LPS的BV2上清組，2、2.5、3 μmol/L 遠志皂苷元BV2上清組均可較為顯著地降低SH-SY5Y細胞NO釋放量(P<0.001)。

3 討論

目前，因化療藥物所產生的不良反應，如：周圍神經病變等神經毒性效應，在很大程度上影響了其臨床使用。而對于某些高效抗腫瘤藥，如鉑類似物或紫杉烷家族成員而言尤為嚴重，由于這些藥物一般需依賴劑量或治療方案來發揮治療效果。這種神經毒性效應將嚴重影響患者的生活質量[19]，即使在化療停止很長一段時間仍存在。盡管可見一些神經再生，但其再生速度緩慢，且在很多情況下，神經病變的逆轉也并不完全，甚至還可能影響生活質量及正常功能長達多年。

“化療腦”作為一種神經系統的疾病，主要是癌癥患者化療后的認知功能的受損[20]，但其誘因較為復雜，發生機制仍未明確。有猜測“化療腦”是異常大腦重構、延緩的損傷修復系列活動后，為神經-內分泌-免疫學改變所導致的結果[21]。有研究報道化療可引起促炎細胞因子水平的升高，引起炎癥反應，可能是周圍組織中產生的炎癥因子，穿過血腦屏障影響大腦功能，也可能是化療后直接導致大腦內部產生炎癥反應，這點尚未明確[22-23]。但有研究明確炎癥因子與化療后認知障礙的發生密切相關，且化療后大量炎癥因子的產生又促進了患者“化療腦”的發展[24]。體外實驗中發現5-FU等可顯著地促進促炎因子的產生[25]。有學者發現在惡性腫瘤如乳腺癌、霍奇金病等患者體內炎癥因子水平顯著升高[26-27]、神經元凋亡，猜測這一改變與“化療腦”的發生密切相關?？煽隙ǖ氖茄装Y反應及其相關細胞因子可致神經元受損并降低海馬神經元再生功能，導致認知障礙[28]。因此，抑制炎癥因子的釋放，可能對改善神經損傷及延緩“化療腦”具有重要的意義。

本研究中不同濃度遠志皂苷元對LPS誘導的BV2細胞產生NO的影響的濃度篩選結果顯示， 5、25、50、100 μmol/L的遠志皂苷元均無抗炎癥反應作用，且與LPS組相比，5、25、50、100 μmol/L的遠志皂苷元反而有明顯地促炎作用，以100 μmol/L效果最顯著(P<0.001)；而1.5、2、2.5、3、3.5 μmol/L的遠志皂苷元均可顯著地降低NO釋放，尤以2 μmol/L遠志皂苷元降低作用較為顯著(P<0.001)。表明低濃度遠志皂苷元可降低NO釋放，可能具有抗炎癥作用。環氧化酶(cyclooxygenase,COX)是花生四烯酸代謝前列腺素過程的主要限速酶，COX同工酶一COX-2是一種重要的炎癥介質，炎癥反應伴隨 COX-2表達增加與許多神經疾病的病理過程中神經元的變性和凋亡有關。Yang等[29]發現經甲氨蝶呤治療乳腺癌小鼠后其海馬功能障礙，與其前列腺素合成酶、COX-2 及NO 合成酶iNOS表達上調密切相關。在認知障礙患者或動物模型的研究中發現，氟西汀可通過提高海馬神經的再生及可塑性，增加腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)的表達，來改善其認知功能[30-31]。仝太山等[32]研究發現乳腺癌患者化療后的認知功能障礙與其自身BDNF水平下降具有顯著相關。茅東升等[33]報道NGF可減少 LPS 引起的 PC12 細胞的壞死和凋亡，對LPS損傷具有保護作用。還有研究報道NGF可抑制LPS誘導的成骨細胞產生NO，同時抑制COX-2 mRNA的表達，具有抗炎作用[34]。前期研究中，我們發現遠志皂苷元可促進神經突起生長、促進細胞存活，具有類似神經營養因子作用，且還發現遠志皂苷元可提高BDNF mRNA表達水平[16-18]。本研究選取2、2.5、3 μmol/L的遠志皂苷元作用于LPS誘導的BV2細胞，觀察炎癥因子COX-2的表達情況。結果顯示，遠志皂苷元可不同程度地抑制炎癥相關蛋白 COX-2的表達，以2 μmol/L遠志皂苷元抑制作用較為明顯(P<0.05)(圖2、3)。表明遠志皂苷元可抑制神經炎癥因子釋放，具有改善神經損傷的作用。

本研究還觀察了遠志皂苷元對SH-SY5Y接受BV2炎癥上清刺激后是否具有保護作用，發現遠志皂苷元不僅可促進BV2炎癥上清刺激后的SH-SY5Y細胞的存活，且呈劑量依賴性；還可顯著地降低SH-SY5Y接受BV2炎癥上清刺激后NO的釋放，這表明遠志皂苷元可能具有降低炎癥反應的作用，具有神經保護作用。

綜上所述，遠志皂苷元不僅可降低LPS誘導后炎癥介質NO的釋放，抑制炎癥介質COX-2的表達；也能促進SH-SY5Y接受BV2炎癥上清刺激后細胞存活的同時抑制NO的釋放量，表明遠志皂苷元具有類似神經營養因子作用，改善神經炎癥病變，具有潛在的緩解“化療腦”的作用。在下一步實驗中，將建立不同的細胞及動物模型，如化療藥物損傷模型等，進一步觀察遠志皂苷元的神經保護作用，為“化療腦”的治療提供新方向、新思路。