血常規和血生化指標在患強直性脊柱炎食蟹猴中的臨床價值

李玉瑩，麥冬梅，賈歡歡，吳志恒，何剛華，唐爽捷，馬承紅，盧 麗*

(1.廣東藥科大學，廣州 511400； 2.廣東省實驗動物監測所(廣東省實驗動物重點實驗室)，廣州 510663； 3.廣州春盛生物研究院有限公司，廣州 510900； 4.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣州 510000)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種病因未明的自身免疫性疾病，主要累及骶髂及脊柱關節[1]，青少年多發，男性多于女性，隨著病情的進展，AS患者的生活質量會受到極大的影響，目前尚無良好的治療藥物和干預措施。

疾病動物模型的構建是研究疾病發生機理和防治策略的基礎[2]，隨著對強直性脊柱炎病因病機的研究，國內外學者已構建了若干個強直性脊柱炎動物模型[3]，遺憾的是這些模型均為嚙齒類動物模型，與AS患者臨床表現存在較大差異。非人靈長類動物在遺傳背景、生理結構等方面與人類高度相似[4-5]，課題組經過多年研究，建立了一種自發性AS食蟹猴動物模型，將為AS相關藥物的安全性和有效性評價起到重要作用。動物外周血血常規、血生化指標的檢查，是藥物安全性和有效性評價最常用的評價指標，本研究將對AS食蟹猴血常規和血生化指標進行檢測和評價，以期尋找到適合AS食蟹猴評價的關鍵指標，為AS的后續研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

從約2000只食蟹猴群體中，篩選自發性AS食蟹猴 40 只，雌性 27 只，雄性 13 只，年齡：(10.22±3.00)歲，體重:(4.46±1.93)kg；篩選雌性 25 只，雄性 15 只，年齡：(11.00±3.19)歲，體重:(5.52±1.60)kg。已適應喂養2年。兩組動物年齡性別等基本生理參數均衡可比。級別：普通級；動物由廣東春盛生物科技發展有限公司提供[SCXK(粵)2019-0027]。已經通過廣東省實驗動物監測所IACUC的審查(IACUC2018002)，符合“3R”原則。飼養條件：群居飼養于廣東春盛生物研究院有限公司[SYXK(粵)2015-0152]，環境溫度18℃～26℃，相對濕度 40%～70%，自然采光。

1.2 主要試劑與儀器

血常規：血紅細胞分析用稀釋液(CELLPACK DFL)、Hb溶血劑 (SULFOLYSER)、WNR 溶 血劑 (Lysercell WNR)、WDF 溶血劑(Lysercell WDF)、WDF 染色液(Fluorocell WDF)、WNR染色液(Fluorocell WNR)、PLT 熒光染色液(Fluorocell PLT) (批號分別為:A7010、A7014、A8006、A7019、A7062、A7047、A7094，日本 Sysmex 株式會社)；血液分析儀XN-1000 V[B1]型(日本 Sysmex 株式會社)。

血生化：白蛋白試劑盒、總蛋白試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒。試劑均為上海科華生物工程股份有限公司產品；儀器使用3100型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 AS動物選擇

通過對動物進行體格檢查，并使用測角儀來評估脊柱的曲率和膝關節和髖關節的運動范圍(ROM)進行自發性AS動物的初篩[6]，隨后進行X線檢查，判斷標準與人類AS患者判斷標準相同：0 級：影像學檢查未見病變，骨質結構完全正常；Ⅰ級：骨關節疑似存在硬化、侵蝕現象；Ⅱ級：可見明顯硬化及侵蝕現象，并表現出輕度異常情況，但關節間隙不十分明顯改變；Ⅲ級：出現明顯骨質硬化及侵襲現象，可見骨質重度異常，關節腔隙可見明顯改變，見部分強直變化；Ⅳ級：大部分脊柱出現強直變化或完全強直，表現出嚴重骨關節結構異常[7]。再配合細胞因子檢查：C-反應蛋白(C-reactionprotein，CRP)、含有瓜氨酸抗體的抗環肽(抗CCP抗體)、抗鏈球菌溶血素O(anti-Streptolysin，ASO)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和類風濕因子(IgG-RF& IgM-RF)。并排除其他疾病，如(1)自身免疫性疾病(類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等)；(2)合并感染性疾病或貧血；(3)患有血液學疾病；(4)肝、腎功能損害；(5)患有心腦血管疾病；(6)患有惡性腫瘤。

1.3.2 樣本采集

(1)血常規樣本采集

動物禁食過夜后，非麻醉狀態下使用 2 mL 含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空采血管對實驗動物采用前肢頭靜脈采血 2 mL，保存樣本并于1.5 h內送檢。

(2)血生化樣本采集

1976年，美國學者Cremin在《公共教育》一書中正式提出了教育生態學的概念，正式把焦點集中在教育與周圍環境因素的相互作用關系，為教育學的發展思路提供了新的視角。1987年，美國學者Goodlad提出了“文化生態系統(cultural ecosystems)”的概念，指出學校應從管理入手統籌各種生態因子提高辦學效果。

動物禁食過夜后，非麻醉狀態下使用 3 mL 促凝真空管對實驗動物采用前肢靜脈采血3 mL，樣本于1.5 h 內送檢。血液樣本室溫下靜置3 h后，3000 r/min，離心10 min，取血清。

1.3.3 指標測定

(1)血常規指標測定

使用 Sysmex XN-1000 V 全自動血液分析儀對動物抗凝血進行以下指標測定:白細胞計數(WBC)、血小板計數(PLT)、平均血小板體積(MPV)、中性粒細胞(NEUT)、淋巴細胞(LYMPH)、單核細胞(MONO)、嗜酸性粒細胞(EO)、嗜堿性粒細胞(BASO)。計算中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)、單核細胞與淋巴細胞比值(MLR)、嗜酸性粒細胞與淋巴細胞比值(ELR)、嗜堿性粒細胞與淋巴細胞比值(BLR)。

(2)血生化指標測定

使用全自動生化分析儀檢測本實驗相關的生化指標，包括：堿性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLOB)、總膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、白蛋白與球蛋白比值(A/G)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 AS組食蟹猴與對照組食蟹猴的檢測指標的比較

與對照組相比，AS組WBC、NEUT、MONO、EO、BOSO、MPV、NLR、MLR、ELR和BLR均顯著升高，LYMPH顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；PLT無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 AS組與對照組的血常規指標的對比Table 1 Comparison of complete blood count indexes between AS group and control group

2.1.2 血生化指標的比較

與對照組相比，AS組TP、GLOB、ALP、CHO顯著升高；ALB、A/G、HDL-C、LDL-C顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；TG無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.2 ROC曲線評價研究指標對AS食蟹猴的診斷價值

2.2.1 血常規指標對AS食蟹猴的診斷價值

使用ROC來評價MPV、WBC、BASO、EO、MONO、LYMPH、NEUT、NLR、MLR、ELR和BLR對AS食蟹猴的診斷價值，結果顯示它們的AUC值分別是：0.736(0.626～0.846)、0.788(0.688～0.889)、0.683(0.566～0.801)、0.815(0.716～0.914)、0.681(0.564～0.797)、0.215(0.118～0.313)、0.85(0.768～0.933)、0.894(0.826～0.961)、0.896(0.828～0.963)、0.87(0.789～0.951)、0.897(0.832～0.963)。其中各白細胞比值(NLR、MLR、BLR、ELR)的AUC值均高于其他指標，BLR的AUC值最高，靈敏度和特異度分別為0.75和0.92。(圖1、表3)

表2 AS組與對照組的血生化指標的對比Table 2 Comparison of blood biochemical indexes between AS group and control group

2.2.2 血生化指標對AS食蟹猴的診斷價值

使用ROC來評價TP、ALB、GLOB、A/G、CHO、HDL-C、LDL-C和ALP對AS食蟹猴的診斷價值，結果顯示它們的AUC值分別是：0.678(0.562～0.795)、0.048(0.007～0.09)、0.942(0.889～0.995)、0.047(0.002～0.091)、0.719(0.606～0.831)、0.295(0.182～0.408)、0.333(0.211～0.455)、0.934(0.880～0.987)。其中GLOB和ALP的AUC值均高于其他指標，GLOB的AUC值最高，靈敏度和特異度分別為0.878和0.975。(表4、圖2)

圖1 ROC曲線評價研究血常規指標對AS 食蟹猴的診斷價值Figure 1 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

表3 ROC曲線評價血常規指標對AS食蟹猴的診斷價值Table 3 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

表4 ROC曲線評價血生化指標對AS食蟹猴的診斷價值Table 4 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

圖2 ROC曲線評價研究血生化指標對AS 食蟹猴的診斷價值Figure 2 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the blood biochemical index for AS cynomolgus monkeys

3 討論

強直性脊柱炎是以中軸和骶髂附著點炎癥為主要癥狀的全身免疫性疾病，發病早、致殘率高、病程長，目前尚無良好的治療手段[10]。目前，AS的病情評估和診斷主要依靠臨床表現、影像學及ESR、CRP等指標檢查，但是影像學檢查價格昂貴且不便，不適合AS食蟹猴較多數量的初篩。本研究通過對血常規、白細胞比值(NLR、MLR、ELR、BLR)和血生化部分指標的分析來探究各指標對AS食蟹猴的診斷價值。

NLR和MLR作為炎癥標志物在很多疾病中被關注，NLR和MLR異常增加與一些疾病炎癥活動或預后有關，如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、骨關節炎等[11-12]。本研究結果顯示與正常對照組的食蟹猴相比，AS食蟹猴的NLR和MLR均顯著升高。也有文獻結果顯示在AS中NLR與ESR和CRP呈正相關[13]，MLR與CRP呈正相關[14-15]。嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞都是一種免疫效應細胞，通常占血液白細胞的5%和1%以下。本研究結果表明在AS食蟹猴中EO和BASO均顯著增高，這可能與AS是一種慢性炎癥為主的自身免疫性疾病有關。周振興等[16]研究表明由于大量炎癥介質和細胞因子的異常分泌導致患者嗜酸性粒細胞顯著增高；嗜堿性粒細胞除了在過敏反應和寄生蟲感染中的活性外，Chirumbolo等[17]研究證明在固有免疫和免疫調節中具有重要作用發生炎癥時血液中的血細胞比例發生變化。目前關于ELR和BLR的研究較少，但是在本研究結果中AS食蟹猴的ELR和BLR升高，并有統計學意義，這與Yang等[13]的研究中關于AS病人的結果基本一致。MPV是血小板活化的標志物，Kisacik等[18]研究發現MPV可能是診斷AS靈敏度更高的指標，并且發現MPV在AS的活動期呈較低水平，在非活動期MPV水平較高。在我們的研究結果中AS組的食蟹猴較正常對照組的食蟹猴的MPV顯著升高，而PLT無顯著性差異，與Kisacik等[18]的研究結果中的AS病人非活動期指標變化相符。本研究探討血常規和血生化指標的檢測對自發性AS食蟹猴的診斷價值。ROC曲線結果顯示，在血常規指標中，白細胞比值的各指標(NLR、MLR、ELR、BLR)的靈敏性和特異性都均高于各類白細胞指標，與文獻報道一致[14]。

ALP 主要由肝和成骨細胞合成，是反映成骨活動的重要標志物，本研究結果顯示AS食蟹猴ALP顯著升高，這可能是隨著疾病進程會出現脊柱及關節骨化導致。GLOB 是一個計算值,是血清中的“非白蛋白”蛋白的總量,免疫反應增強是AS重要的臨床表現,GLOB的升高可能是由于AS的炎癥特征導致機體免疫蛋白升高。張曉剛等[19]的研究結果表現為人類AS患者的TG和CHO顯著升高，LDL-C和HDL-C 下降，與本研究結果中AS食蟹猴的指標大致相同。ALB是主要用于反映機體營養狀態和慢性消耗性疾病的指標之一[20-21]，AS食蟹猴由于疼痛和全身炎癥會導致機體營養吸收和物質代謝能力降低，從而表現出ALB和A/G低于正常食蟹猴。在血生化指標中，GLOB和ALP的AUC值均大于0.9，證明它們對于AS食蟹猴的診斷靈敏度和特異度較好。

綜合上述討論，本研究發現血常規、血生化檢查可作為一種快速、簡便、可靠的手段，對自發AS食蟹猴模型進行篩查、診斷和相關藥物的評價提供輔助診斷的手段。綜合ROC曲線結果，指標NLR、MLR、ELR、BLR、ALP和GLOB是本研究指標中靈敏度和特異度最佳的六個指標，并且它們的變化可能與AS疾病活動度有關，對AS有重要的臨床應用價值。但是，本研究樣本量相對較小，還需后續進行縱向研究，包括較大量的數據分析來進一步探究這些指標與疾病活動度的相關情況。