羊棲菜多糖對3T3-L1前脂肪細胞分化及其相關基因表達的影響※

●楊旭東 石 杰 楊驕霞 王桂云 宋高臣 張 杰▲

脂肪細胞是人體中重要的能量儲存庫，現代研究表明，脂肪細胞的數目增加、過度分化及代謝紊亂，與糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病密切相關[1]。因此，如何控制脂肪細胞生長和分化已成為治療相關疾病的作用研究靶點。羊棲菜是一種食用海藻，隸屬于褐藻門、馬尾藻科、馬尾藻屬。羊棲菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccha-ride，SFPS）從海藻羊棲菜中提取，研究發現其具有降血脂、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、增強免疫力等生物活性[2-4]，本課題組前期的實驗研究發現，SFPS 具有降低糖尿病大鼠血脂、改善胰島素抵抗等作用[5-6]，但SFPS 對脂肪細胞的增殖分化的影響及其機制未見報道。本研究觀察SFPS對3T3-L1 前脂肪細胞是否具有抑制增殖分化的作用，并研究其對相關基因表達的影響。

1 材料

1.1 材料與試劑前脂肪細胞3T3-L1 購自美國ATCC公司（批號：62996847）；DMEM高糖培養液購自美國Gibco 公司（批號：1782825）；Trizol 購自美國Gibco 公司（批號：15596-026）；MTT 購自索萊寶有限公司（批號：303H0524）；胰蛋白酶購自上海生工（批號：825J041）；PPARγ 抗體購自英國Abcam 公司（批號：ab24509）；FAS 抗體購自美國CST 公司（批號：31080T）；β-actin 抗體購自美國CST 公司（批號：4970T）；HRP 標記IgG 二抗購自英國Abcam 公司（批號：ab45966）；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器和設備RCO-3000T-5V CO2恒溫培養箱（美國G.S.公司）；7500 ABI 熒光定量PCR（美國Bio-Rad公司）；UV-5200PC紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；Elx808酶標儀（美國Biotek 公司）；DYJ-909 倒置顯微鏡（上海點應光學儀器有限公司）；Universal HoodII凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 SFPS 的制備經200 目粉碎的干燥羊棲菜，先用水煮醇沉法提取[7-8]，經3次水煮，3倍體積的95%乙醇沉淀，得到羊棲菜粗多糖（深褐色），然后用Sevag法去除羊棲菜粗多糖中的蛋白成分得到初步純化的多糖，通過SephadexG200凝膠柱用雙蒸水洗脫分離純化SFPS。用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，以葡萄糖為標準品，測得羊棲菜粗多糖中多糖含量為55.13%。

2.2 細胞培養根據參考文獻[9]，3T3-L1 細胞培養于DMEM高糖培養基（10%新生牛血清、100mg/L鏈霉素、100IU/L青霉素），5%CO2培養箱，37℃培養。

2.3 MTT 檢測3T3-L1 前脂肪細胞相對增殖率3T3-L1 前脂肪細胞中選取對數生長期的，以1×104/mL 的細胞濃度，接種于96 孔板，培養12h 后，將細胞分為對照組（Control Group）、SFPS 100 mg/L 組（SFPS 100 mg/L Group）、SFPS 200 mg/L 組（SFPS 200 mg/L Group）和SFPS 400 mg/L 組（SFPS 400mg/L Group），每個劑量設6 個平行孔。繼續培養24h、48h、72h 后，每孔加入20μL MTT（5g/L）（調零組除外），4h后，棄去上清，加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩15min，結晶物完全溶解。酶標儀于570nm處比色，測定各孔光密度（OD）值。根據OD 計算細胞相對增殖率（Relative Growth Rate，RGR），按下列公式計算RGR。RGR＝實驗組OD值／對照組OD值×100%。

2.4 3T3-L1 細胞內總脂質及細胞分化抑制率的測定3T3-L1 前脂肪細胞以1×104/mL 的細胞濃度，接種于96 孔板，將細胞分為對照組（Control Group）、SFPS 100 mg/L 組（SFPS 100 mg/L Group）、SFPS 200 mg/L 組（SFPS 200 mg/L Group）和SFPS 400 mg/L 組（SFPS 400 mg/L Group），每個劑量設6 個平行孔。待細胞生長融合后48h（開始誘導分化，誘導分化第0天），含10%胎牛血清的DMEM 培養液中加入胰島素（10μg/mL）、IBMX（0.5mmol/L）、地塞米松（1mmol/mL）誘導分化培養2d。棄上清，然后用加入胰島素（10mg/L）的DMEM 培養液繼續培養2d。更換DMEM培養液，繼續培養9d，細胞分化基本完成，細胞胞漿中充滿脂滴，形狀接近圓形。另未分化細胞組（Undifferentiated cell group，UD Group）培養于DMEM高糖培養基（10%FBS），5%CO2培養箱，37℃培養，隔天換液，繼續培養9d。在分化第9d，細胞用多聚甲醛（4%）固定30min，加入油紅O∶去離子水=3∶2的染料，染色60min，PBS 清洗2 次，顯微鏡下觀察細胞內有紅染的脂滴，細胞分化成熟。加入異丁醇250μL，反復吹打振蕩5min，溶解油紅O 染料，吸取150μL 染料溶解液，酶標儀于510nm，測定各組OD 值，半定量脂肪細胞中總脂質含量并計算細胞分化抑制率。細胞分化抑制率（%）=（OD 對照組-OD 藥物組）/OD 對照組×100%。

2.5 SFPS 對3T3-L1 細胞TG 的影響在分化第9d，收集分化成熟的細胞后，用細胞裂解液裂解細胞，離心取上清，按照TG 測定試劑盒說明操作，測定TG含量。于500nm 處測定吸光度值，吸光度值與TG 濃度呈正比，TG單位為mmol/L。

2.6 SFPS對3T3-L1細胞中PPARγ、FAS蛋白表達的影響按照上述方法誘導3T3-L1 前脂肪細胞分化，在誘導分化開始，加入不同濃度的SFPS，每個劑量設6 個平行孔。在分化第9d，收集分化成熟的細胞，測定PPARγ、FAS 蛋白表達量。裂解細胞提取蛋白：加入100μL細胞裂解液，冰上裂解細胞10min，用細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白，BCA 法定量。電泳：每組取40μg 蛋白，加樣于10%SDS-PAGE 中電泳分離。轉膜封閉：電泳結束后，濕式轉膜法280mA 70min 轉移蛋白至PVDF 膜，5%脫脂奶封閉液，室溫封閉2h。特定蛋白測定：分別加入對應的一抗，4℃孵育12h；TBST 洗膜10min×3 次，加入相應的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，孵育2h 后，棄去二抗；TBST 洗膜10min×3 次，加入顯影劑ECL200mL，定影。用凝膠成像系統進行灰度值分析。

2.7 統計學分析統計學處理采用SPSS 18.0 軟件，實驗數據以（）表示，組間差異比較采用ANOVA檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 SFPS 對3T3-L1 前脂肪細胞相對增殖率的影響不同濃度的SFPS 處理3T3-L1 前脂肪細胞24h、48h后，與對照組比較，各劑量組的細胞相對增殖率無統計學差異(P＞0.05)；而在72h 后，與對照組比較，400 mg/L 組的細胞相對增殖率顯著下降(P＜0.05)。表明SFPS 在100～400 mg/L 的劑量范圍內，培養72h，對3T3-L1的增殖有抑制，但抑制作用不顯著。見表1。

3.2 SFPS對3T3-L1細胞總脂質及分化抑制率的影響與對照組比較，不同濃度SFPS作用后，分化成熟的脂肪細胞中總脂質含量顯著降低（P＜0.01），SFPS 400 mg/L組降低最明顯，說明SFPS在脂肪細胞分化過程中能夠減少細胞中總脂質含量。并通過測定的OD值，計算出脂肪細胞分化抑制率，SFPS 100 mg/L 組、SFPS 200 mg/L組和SFPS 400 mg/L組的細胞分化抑制率分別為14.51%、21.82%、44.11%。說明不同濃度SFPS 均可抑制脂肪細胞的分化（P＜0.01），SFPS 400 mg/L組抑制效果最顯著（P＜0.01）。見圖1。

表1 SFPS對3T3-L1前脂肪細胞相對增殖率的影響（，n=6）

表1 SFPS對3T3-L1前脂肪細胞相對增殖率的影響（，n=6）

注：與對照組比較，*P＜0.05

3.3 SFPS 對3T3-L1 細胞中TG 含量的影響與對照組比較，不同濃度SFPS作用后，分化成熟的脂肪細胞中TG含量顯著降低（P＜0.01），SFPS 400 mg/L組TG含量降低最明顯，說明SFPS 在脂肪細胞分化過程中能夠減少細胞中TG含量。見圖2。

3.4 SFPS對3T3-L1細胞中PPARγ、FAS蛋白表達的影響與對照組比較，SFPS 各劑量組PPARγ、FAS蛋白表達量均顯著降低（P＜0.01），且PPARγ、FAS 蛋白表達量隨著SFPS 濃度的增高而逐漸降低。說明SFPS 在脂肪細胞分化過程中，能夠通過影響細胞中PPARγ、FAS 蛋白表達量來抑制3T3-L1 細胞分化。見圖3。

圖1 SFPS對3T3-L1細胞中脂質含量的影響

圖2 SFPS對3T3-L1細胞甘油三酯含量的影響

圖3 SFPS對3T3-L1細胞中PPAR-γ、FAS蛋白表達的影響

4 討論

SFPS 是從褐藻門食用海藻羊棲菜中提取的多糖成分，主要包括褐藻淀粉、褐藻糖膠和褐藻酸。SFPS已被證實在脂代謝中具有降血脂、抑制脂質沉積和保護脂肪變的肝細胞等作用[10-11]，本課題組前期的實驗研究也進一步驗證了其在脂代謝中的作用。肥胖、脂肪細胞的過度增殖分化及代謝紊亂與多種疾病相關[12]，因此，本實驗進一步研究SFPS對3T3-L1前脂肪細胞分化是否具有抑制作用，并初步探討其作用機制。

前脂肪細胞要經過融合前增殖、接觸抑制、克隆擴增、擴增停止四個階段分化為成熟的脂肪細胞[13]，此過程中需要多種轉錄因子誘導細胞轉化，促進脂滴形成。PPARγ屬于核內受體轉錄因子超家族，是眾多脂肪分化因子中最關鍵的，可直接調控脂肪細胞分化，參與脂的代謝[14-15]，PPARγ與生理性或藥理性配體結合后，改變構象，結合相關DNA上的PPARγ反應元件，從而調節相關基因的轉錄。PPARγ是脂肪細胞分化過程中必須的轉錄因子，可進一步調控脂代謝的相關酶的表達。為了研究SFPS 對3T3-L1 前脂肪細胞分化的影響，誘導分化開始，加入不同濃度的SFPS。實驗結果顯示，在分化第9d，不同濃度的SFPS各組細胞中PPAR-γ蛋白的表達量顯著減少。

FAS 是脂肪酸合成的關鍵酶[16]，以乙酰輔酶A 為原料催化生成長鏈脂肪酸，并進一步形成甘油三酯儲存于細胞中。實驗研究表明，脂肪組織中FAS 的mRNA 表達量與肥胖是正相關的，抑制FAS的量可以減少脂滴的生成[17-18]。PPARγ是前脂肪細胞分化關鍵的轉錄因子，而FAS 出現在分化的中期、后期，屬于PPARγ 下游靶基因之一，調節脂類的合成、儲存。實驗結果顯示，在分化第9d，不同濃度的SFPS各組細胞中FAS 蛋白的表達量顯著減少，表明SFPS 可通過降低FAS蛋白的表達，抑制3T3-L1中脂質的生成。

本研究結果顯示：①SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪細胞分化，減少脂肪細胞中總脂質及TG的含量，濃度越大，抑制作用越明顯。②SFPS 可以明顯下調3T3-L1細胞PPARγ蛋白的表達，降低FAS蛋白的表達。實驗結果提示，SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪細胞分化的分子機制可能與調控PPARγ和FAS蛋白的表達有關。