細菌纖維素生物合成調控及在食品領域的應用研究進展

畢繼才,劉四新,李從發

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉453003;2.海南大學食品科學與工程學院,海南海口 570228;3.海南大學理學院,海南海口 570228)

靜止培養Komagataeibacterxylinus時,在培養基表面生成白色薄膜凝膠狀物質為細菌纖維素(Bacterial cellulose,BC)[1]。已報道的能產細菌纖維素的菌屬有17個,分別是:Acetobacter(醋桿菌屬)、Agrobaeterium(土壤桿菌屬)、Achromobacrer(無色桿菌屬)、Azotobacter(固氮菌屬)、Aerobacter(氣桿菌屬)、Alcaligenes(產堿菌屬)、Rhizobium(根瘤菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Sarcina(八疊球菌屬)、Enterobacter(腸桿菌屬)、Zoogloea(動膠菌屬)、Salmonella(沙門氏菌屬)、Vibrio(弧菌屬)、Escherichia(埃希氏菌屬)、Klebsiella(克雷伯氏菌屬)、Glucoacetobacter(葡糖醋桿菌屬)、Komagataeibacter(駒形氏桿菌屬)[2-3]。發現最早也是研究最全面最透徹的是K.xylinus,也是闡述纖維素的生物合成及調控機制的模式菌株(Type strain)[4]。細菌纖維素生產菌株利用發酵培養基合成細菌纖維素,培養基成分可以通過抑制或激活微生物代謝途徑中的酶或調控因子來影響代謝途徑的選擇和代謝速率。

圖1 細菌纖維素生物合成與調控

細菌纖維素是典型的膳食纖維素,被美國FDA認定為公認安全級(Generally recognized as safe,GRAS)。細菌纖維素在食品行業可作為重要的食品添加劑、包裝材料以及膳食纖維的來源[5-6]。這主要是基于其優越的食品學特性,如:a.細菌纖維素是由微生物產生的具有高純度,不需要劇烈的化學處理的天然纖維素;b.細菌纖維素的生產可以用天然水果汁培養基,賦予細菌纖維素天然的果汁的香味和顏色;c.細菌纖維素可塑性極強,可以加工成任意形狀,如薄膜、粒狀、方形、長條形、球形以及一些特制的模具的形狀,能夠滿足不同人群的消費需求;d.細菌纖維素具有納米級的3D空間結構,可以用在新食品工業加工領域。e.細菌纖維素產生可以通過對生產菌株合成調控,這個特性將在現代食品3D打印技術領域運用具有良好的前景。

通過對細菌纖維素的生物合成和調控以及其在食品工業領域中的應用研究的梳理,可以為生產出更加符合食品工業需要的細菌纖維素產品提供新的思路。

1 細菌纖維素的生物合成

1.1 合成途徑

Komagataeibacterxylinus是研究細菌纖維素的合成與調控以及分泌、組裝和結晶的模式菌株。根據現在的研究進展,將其細菌纖維素的生物合成調控過程概括為(如圖1)。

首先,是以Komagataeibacterxylinus利用葡萄糖和其他類型的碳源諸如甘油、乙醇、檸檬酸和丙酮酸等,分別通過葡萄糖轉化途徑、己糖單磷酸途徑和三羧酸循環等將其產生細菌纖維素(如圖2)[7-8]。

其次,產細菌纖維素的過程中影響其生物合成過程有兩支旁路(如圖2)。第一條支路是以葡萄糖和果糖作為唯一碳源時,通過葡萄糖己糖激酶和葡萄糖酸脫氫酶將葡萄糖轉變為葡萄糖酮酸(Gluconic acid)[7]。利用G.xylinus作為生產細菌纖維素的菌株時隨著葡萄糖酮酸的積累可以將發酵培養基中的pH降低[9],如果pH降低到生產菌株的可耐受pH以下,就會導致細胞的代謝活性降低而且細胞數量降低,從而導致細菌纖維素的產量降低。通過現代分子生物學的基因敲除(Gene knock-out)技術獲得的一株不產葡萄糖脫氫酶的代謝缺陷型菌株,該菌株在以葡萄糖做為碳源的時候,在有氧條件發酵生產細菌纖維素,其產量可以提高1.7倍[10]。

第二支旁路是尿苷二磷酸葡萄糖在乙酰膠合成酶的催化下產生一種黏性多糖——乙酰膠[11-12](Acetan,其中葡萄糖∶葡萄糖醛酸∶甘露糖∶鼠李糖的含量比例為4∶1∶1∶1)。研究發現了一株G.xylinusBPR2001的乙酰膠缺陷型突變株EP1[13],影響細菌纖維素在動態培養產量的原因是：動態培養時乙酰膠增加了發酵液的黏度,防止菌體與細菌纖維素之間的交聯凝聚,而使得細菌纖維素的產量提高。

圖2 生物合成細菌纖維素過程中的兩支旁路

最后,在細菌的細胞膜上利用冰凍蝕刻和電鏡技術中能夠觀察到纖維素酶復合物,這些酶復合物稱為終端復合物(Terminal complexes,簡稱TCs)[14-15]。通過細菌纖維素生產缺陷突變體的研究確定了其為四種基因組成分別為:CeSA、CeSB、CeSC和CeSD。其中CeSA、CeSB和CeSC參與細菌纖維素的合成;CeSD參與合成后的纖維素鏈的繼續結晶化過程[16-17]。

1.2 細菌纖維素的生物合成調控

細菌纖維素的生物合成過程受到基因、代謝和細胞三個不同水平上的調控。

1.2.1 基因水平的調控 在G.xylinus是纖維素合成酶基因旁邊發現三個上游基因和兩種酶。在這三個基因中,推測第一個開放閱讀框(ORF1)編碼的是纖維素酶活性相關的酶(內切葡聚糖酶,Endoglucanase)[18],細菌和植物體內的內切葡聚糖酶被認為可能是纖維素合成中編輯/成鏈的終止子(Terminator)[19-20];第二個開放閱讀框(ORF2)與形成細菌纖維素(天然纖維素I型)的高級結構有關,當以上兩個基因中的任一個被破壞,G.xylinus就不能產生細菌纖維素[21];第三個開放閱讀框(ORF3)可能在纖維素I和II間部分轉化過程中起到關鍵作用[22]。在G.xylinus中含有一種膜蛋白,稱為纖維素的補體因子(Cellulose complementing factor簡稱Ccp),具有與纖維素合成酶復合體(也稱為終端復合物)相似的功能。細菌纖維素合成途徑中可能仍然含有其他未知組分有待進一步研究[23]。

1.2.2 代謝水平的調控G.xylinus的細菌纖維素生物合成途徑時,發現c-di-GMP(3′-5′-cyclic guanosine monophosphate,環-二鳥苷酸單磷酸)在細胞體內可通過與纖維素合成酶變構結合來激活纖維素合成酶活性[24]。研究表明c-di-GMP是在細菌中普遍存在的第二信使分子(Secondmessenger molecule),參與了細胞內多種生理功能的調節過程,如細胞分化(Cell differentiation)、產生致病因子、生物被膜(Biofilm)和細菌纖維素合成等。纖維素合成酶既直接參與細菌纖維素合成,又將它們變成網狀結構。c-di-GMP作為變構效應因子(Allosteric effector)使纖維素合成酶構象發生變化,從而促進纖維素合成酶的反應活性。因此,當細胞內c-di-GMP濃度低時,纖維素合成能力就受到影響[25]。而c-di-GMP濃度受二鳥苷酸環化酶、磷酸二酯酶 A和磷酸二酯酶 B三種酶的調控[26]。二鳥苷酸環化酶有在原生質膜上和細胞質中兩種形式;而磷酸二酯酶A和磷酸二酯酶B都位于原生質膜上。這三種酶形成了纖維素合成酶酶活性的多組分調節控制系統,與c-di-GMP的合成與降解相關。其具體步驟為:a.二鳥苷酸環化酶可催化c-di-GMP的生成,其活性受Mg2+的激活作用;b.磷酸二酯酶 A和磷酸二酯酶 B均可降解c-di-GMP,其中磷酸二酯酶 A的活性受到Ca2+、Fe2+、Ni+抑制,但受到Mg2+、Mn2+、Co3+的激活,而磷酸二酯酶 B不受Ca2+、Fe2+、Ni+影響。磷酸二酯酶 A 催化c-di-GMP成為無活性的線性pGpG,磷酸二酯酶 B進一步將pGpG 轉化為兩個5′-GMP。其中磷酸二酯酶 A的催化步驟是最關鍵的,Ca2+對磷酸二酯酶 A的抑制作用則提供了纖維素合成的另一個調控位點,Ca2+濃度會間接地影響纖維素的合成速率,而高濃度Ca2+可防止纖維素合成酶失活,并可提高纖維素的合成速率。

1.2.3 細胞水平的調控 為了提高纖維素產量,將氨芐青霉素抗性基因構建到G.xylinus和大腸桿菌之間的穿梭質粒(pUF106)上[20]。將帶有目的基因片段的pUF106電轉進目標菌株,可利用含氨芐青霉素的平板篩選轉化成功的菌株。這為使用DNA重組技術將G.xylinus的細菌纖維素合成基因轉進生長速度迅速的菌株如大腸桿菌,并在這些菌株里生產細菌纖維素成為可能。另外一個團隊利用基因工程的方法得到了G.xylinus突變體,該菌株的葡糖酸形成途徑被抑制[27]。從而防止在培養過程中pH的大幅度降低,膜狀纖維素產量是野生型菌株的兩倍,可以作為細菌纖維素工業化生產的菌株。

1.3 細菌纖維素的分泌、組裝和結晶過程研究

K.xylinus是研究細菌纖維素分泌、組裝和結晶三個過程的模式菌株。K.xylinus產生的細菌纖維素的生物合成與通過細胞膜上的微孔分泌到菌體細胞外這兩個過程是同時進行[28]。Kai利用原子力顯微鏡技術研究細菌纖維素的纖維束/纖維帶的形成過程[29]。每個G.xylinus兩側每隔約為1.0 nm就有一個微孔,菌體周身軸向排列分布著約100～160個微孔。微孔的功能能夠使可溶性單根亞原纖維素鏈最終形成不溶性細菌纖維素絲帶,24～48 h后能形成一個纖維束[29]。利用透射電子顯微鏡測量一個纖維束大約包含46根微纖維橫截面平均是1.6 nm×5.8 nm。隨后的研究表明一個完整的纖維束的寬度在40～60 nm之間,其包含的微纖維的寬度在3～4 nm之間[30]。細菌纖維束能夠通過以下三種途徑形成:單根纖維素與單根纖維素之間結合;扭曲的纖維素促進更大的穩定的纖維的形成;其他膠體物質,如細菌分泌的胞外多糖,可促使纖維素之間的粘附,是物理變化過程。形成的納米纖維帶將菌體包圍,并隨著菌體細胞分裂的而延伸增長。眾多細菌產生許多纖維帶,它們之間相互交織,最終能夠形成顯微狀態下無規則的網狀結構;而每個菌體鑲嵌在由自己編織的纖維網絡中,并在發酵培養基中編織一個個纖維網狀的無紡布(Non-woven fabric)[31-32]。通過研究細菌纖維素的合成過程,可以有的放矢地改變細菌纖維素的物理化學性能,從而達到食品工業中所需要的產品特征。為在食品中更廣泛應用提供優質原料。

2 應用于食品領域

2.1 作為食品原料

細菌纖維素(食品行業又叫椰果)本身就是一種高纖維素、低脂肪、低熱量的傳統食材[33]。它是東南亞菲律賓的傳統甜點,當地也稱之為Nata。可以根據生產細菌纖維素的培養基的不同而有不同的名字,如用椰子生產的叫Nata de coco,用菠蘿汁生產的叫Nata de pina[34]。此類甜品具有爽滑、脆嫩的口感,而且可以賦予多種獨特的風味而備受廣大消費者青睞。在我國已廣泛應用于飲料、乳制品、果凍、冰淇淋、糖果、烘焙、罐頭等食品行業[35-39]。

細菌纖維素可以用作保健食品開發材料。研究表明,在模擬消化道中細菌纖維素可以降低膽固醇的含量[40]。Chau等[41]進行人體實驗表明細菌纖維素可以顯著降低人體血清甘油三酯、血清總膽固醇、肝膽固醇等指標。將紅曲霉屬的絲狀真菌與產細菌纖維素菌株共同發酵可獲得紅色的紅曲椰果,其味道如肉可做為素食主義者理想的肉類和海鮮的替代品[42-44]。細菌纖維素必將不斷出現在未來的營養保健產品中。

2.2 作為食品添加劑

由于細菌纖維素凝膠具有很高的持水性、低固形物含量和高膠體強度,而且在低濃度,寬范圍pH和溫度下仍可保持穩定性。首先,細菌纖維素常用作食品成型劑、增稠劑、分散劑、成型劑和高檔乳化劑等[45]。研究表明,在低溫下細菌纖維素具有較好的冷凍保護性質,因此BC常用于于酸奶、奶酪等乳制品,主要起到對活性乳酸菌進行冷藏保護作用[46]。其次,由于細菌纖維素可以改變食品流變學性質,因此可以用作增稠劑、膠凝劑和保護劑等[35-37]。研究表明細菌纖維素添加量為1.0 kg/t時,冰淇淋有較好的抗融性和抗熱沖擊性[47]。最后,細菌纖維素屬于人體不能消化吸收的膳食纖維,屬于低熱量原料,還能保持食品的口感細膩。在肉丸里添加10%的細菌纖維素可以保持肉丸的口感,因此細菌纖維素被認為是食品里肥肉的替代品[48]。Lin等[49]用細菌纖維素代替魚肉醬里的脂肪取得了良好的效果。

2.3 作為食品包裝材料

細菌纖維素經過改性可以作為優良的食品包裝材料。食品的包裝材料要求必須具備優良的阻隔性能,經過酯化的細菌纖維素膜對蒸汽和氣體有良好的阻隔性能[50]。多聚乳酸與細菌纖維素的復合物材料,具有更好的機械性能、透明性和生物相容性[51]。在細菌纖維素里添加防腐劑Nisin制備的包裝材料具有抑制Listeriamonocytogenes和全部的好氧菌的功能,是提高預包裝食品的安全和延長貨架期的一個良好包裝材料[52]。科研工作者在細菌纖維素里進一步添加其他抗菌物質,如山梨酸、金屬納米粒子如銅、金、銀和氧化鋅等,制成的包裝材料同樣具有抗菌效果[53-55]。隨著3D打印技術的日漸成熟[56],用3D打印技術制備的新型細菌纖維素包裝材料也將成為一個新的研究領域。

3 結語與展望

細菌纖維素作為一種新興的生物材料,被廣泛應用于食品領域,具有良好的發展前景。目前,雖然細菌纖維素在食品行業的應用規模較大,但依舊存在產品品種單一等問題,主要集中在傳統食品上,附加值不高。成本和產量仍然是制約細菌纖維素在食品行業大規模發展與應用的關鍵因素,因此尋求細菌纖維素合成的穩定高產菌株,通過調控細菌纖維素的合成來縮短發酵培養周期,豐富原料來源,進一步提高產量、降低生產成本及作為高附加值食品包裝材料等是現階段細菌纖維素在食品領域的研究重點和需要解決的關鍵問題。