超聲輔助酸解-超高效液相色譜-電霧式檢測器測定靈芝多糖的單糖組成

梁 琰,趙志國,張敏敏,劉 倩,耿巖玲,王 曉,趙恒強*

(1.齊魯工業大學(山東省科學院)山東省分析測試中心山東省中藥質量控制技術重點實驗室,山東濟南 250014;2.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018;3.山東迪沙藥業,山東威海 264209)

靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides)是靈芝菌絲的次生代謝產物,是靈芝的主要功效成分,具有降血脂、降血糖、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力等作用[1-3]。多糖是由單糖通過糖苷鍵結合而成,準確測定多糖的單糖組成以及各單糖的含量,對于多糖的質量控制具有重要意義[4-5]。

水解是測定多糖組成的關鍵步驟,不同糖苷鍵對水解的敏感性不同,解聚單糖的難易程度也不同,多糖的水解效率將會直接影響其單糖組成測定的準確性。近年來,研究者們對多糖的降解方法進行了大量研究,主要包括酸水解、堿水解、酶解以及電磁輻射等[6]。其中,酸水解法反應速率快,水解產物發生結構變化的機率較小,所以在多糖的單糖組成分析中應用較廣[7]。但同時也發現,傳統的高溫酸水解方式用于多糖的水解,時間長、能耗大、效率較低[8-9]。超聲提取技術是利用超聲波產生的強烈的空化效應和機械振動加速藥物有效成分進入溶劑,促進提取的進行,增加有效成分的溶出率,提高藥材的利用率,節約能源并且避免了高溫對提取成分的影響,具有省時、節能、提取率高等優點,已經廣泛的應用于天然產物中有效成分的提取[10-12],但在多糖水解方面的應用鮮有報道。

關于單糖組成及含量的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、離子色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)等[13]。因糖類物質沒有紫外吸收,HPLC檢測糖時,需將樣品水解后進行衍生化處理,此過程比較繁瑣,且PMP修飾的單糖不穩定,特別是在低濃度時,易使最終測定的結果缺乏可靠性[14]。GC法具有靈敏度高的優點,但很難將多種單糖一次性分開,分離度有局限性,且GC出峰的重現性很差,需要添加內標物來對單糖進行含量的定量分析,這無疑增加了操作的繁瑣程度[15]。HPAEC-PAD法則使用高pH、高濃度的非揮發性鈉鹽,對儀器系統要求較高,并且不能直接與質譜聯用[16]。單糖分析常用的檢測器主要有紫外檢測器(UV)、示差折光率檢測器(RID)、質譜(MS)等。采用UV檢測器分析時,需先對其進行衍生化操作,步驟較為繁瑣。RID則靈敏度較低,無法進行梯度洗脫,受外界溫度等因素影響較大,系統平衡時間長,特別是對復雜樣品分析效果較差[17]。MS技術具備高特異性和高靈敏度的優勢,可以詳細解析化合物的結構特征,但儀器結構復雜,價格昂貴,使用受到一定的限制[18]。因此,發展簡單、快速、靈敏的單糖組成分析方法,具有重要意義。

超高效液相色譜技術(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)是近年來推出的一種采用亞2微米填料色譜柱的超高效液相色譜系統,具有高分離度、高效率、節省溶劑等優勢[19]。而電噴霧式檢測器(CAD)是近年來在市場上被逐步推廣的一款高靈敏度、通用型檢測器,其檢測信號不依賴于被檢測物質的化學結構,對不同結構的化合物有一致的響應[20],可以避免復雜的衍生化過程。另外,與蒸發光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD)和RID相比靈敏度較高,可以耐受梯度洗脫溶劑。目前,該技術已逐漸用于糖類、脂質類、固醇類和皂苷類等樣品的檢測[21-23]。

本研究建立了超聲輔助酸解(UAH)-UPLC-CAD法測定靈芝多糖單糖組成的方法,并對6批赤芝多糖的單糖組成和含量進行測定,以期為藥食兩用真菌多糖的單糖組成研究提供方法和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對照品:D-阿拉伯糖(LOT:AJ0702FA14)、L-鼠李糖(LOT:SJ0715GA13)、D-(+)-葡萄糖(LOT:S08J6G1)、D-半乳糖(LOT:AJ0603LA14)、D-(+)-木糖(LOT:B02M6W1)、L-(+)-巖藻糖(LOT:TM0312QB14)、D-甘露糖(LOT:A16O6L4546) 購于上海源葉生物科技有限公司(純度均大于98%);乙腈 瑞典Oceanpak,色譜純；95%乙醇 山東禹王實業有限公司化工分公司,分析純;氫氟酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司,色譜純;甲酸銨、濃鹽酸、三氟乙酸 天津市科密歐化學試劑有限公司,分析純;其余試劑 均為分析純；實驗用水 娃哈哈純凈水;干燥的赤芝子實體 購于濟南市藥王樓,產地來源為安徽,由山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為赤芝(Ganodermalucidum)。

色譜柱:Waters Xbridge HILIC(2.1 mm×150 mm,2.5 μm)、Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)、MERCK ZIC-HILIC(2.1 mm×150 mm,2.5 μm);SBL-10DT型恒溫超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;萬分之一電子分析天平 德國Sartourius;賽默飛Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國,Thermo Fisher。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取 將赤芝置于真空干燥箱中(60 ℃)烘干,切片,粉碎,過40目篩。精密稱取2.0 g干燥的樣品粉末置于三角瓶中,加入30.0 mL去離子水,于超聲提取器中提取30 min(90 ℃熱水),后冷卻15 min,將提取液離心(5000 r/min,10 min),抽濾,用水定容至30.0 mL,采用Sevage法除蛋白,直至無蛋白析出。向其中加入4倍體積的95%乙醇,置于4 ℃冰箱中用于沉淀粗多糖(12 h),離心(5000 r/min,15 min),沉淀依次經95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌,后置于水浴鍋中干燥,并用5.0 mL熱水(80 ℃)復溶,再次離心(5000 r/min,15 min),取上清液,用水定容至5.0 mL,備用[24-25]。

1.2.2 多糖的完全水解 吸取700 μL的多糖溶液于水解管中,加入700 μL的三氟乙酸(4.0 mol·L-1)溶液,密封后置于恒溫超聲波清洗機(70 ℃,功率270 W)中,酸解1 h。產物用氮氣吹干并用甲醇洗滌,以除去TFA殘留[26]。

1.2.3 對照品溶液的配制

1.2.3.1 單個對照品溶液的配制 分別精密稱取阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、巖藻糖和半乳糖對照品各1.0 mg,各置于1 mL容量瓶中,配制成質量濃度均為1.0 mg·mL-1的單個對照品溶液,備用。

1.2.3.2 混合對照品溶液的配制 分別精密稱取阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、巖藻糖和半乳糖對照品各1.0 mg,置于1 mL容量瓶中,配制成質量濃度為1.0 mg·mL-1的混合對照品溶液,備用。

1.2.4 樣品溶液的配制 取吹干的樣品用乙腈-水(v∶v=3∶1)溶液定容至1.0 mL,用0.22 μm微孔濾膜過濾后,作為樣品溶液,備用。

1.2.5 檢測色譜條件 流動相A為0.8%甲酸水溶液,B為乙腈,色譜柱:Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)。梯度洗脫程序:0～6 min,85% B;6～8 min,85% B～72% B;8～12 min,72% B;12～15 min,72% B～50% B。進樣量:10 μL;流速:0.4 mL·min-1;柱溫:25 ℃。CAD檢測參數:霧化器溫度35 ℃,氣體源為N2,壓力61.2 Psi,Filter 5.0 sec。

1.3 數據處理

實驗數據分別采用Excel 2010和Origin 7.5軟件進行處理和繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 多糖酸解條件的優化

2.1.1 酸種類的影響 鹽酸(HCl)、氫氟酸(HF)和三氟乙酸(TFA)是常用于多糖水解的酸,其中,TFA因其易于除去的優點而被廣泛采用[27]。從圖1(A)可以看出,當采用鹽酸和氫氟酸用于靈芝多糖水解時,均有部分單糖未檢出。而在三氟乙酸的酸解作用下,產物中7種單糖均可被檢出。因此,本實驗選TFA用于靈芝多糖的水解。

2.1.2 酸濃度的影響 如圖1(B)所示,隨著TFA濃度的增加各特征峰的峰面積呈現先升高后下降的趨勢,當濃度為4 mol·L-1時,水解程度達到最大,這可能是由于酸濃度過高時,單糖則易轉化成糠醛及其衍生物,而濃度低時,水解程度則較低,大部分以多糖的形式存在。因此,選定TFA的濃度為4 mol·L-1。

圖1 酸種類(A)及濃度(B)對水解程度的影響

2.1.3 超聲功率的影響 如圖2(A)所示,超聲功率在150～270 W范圍內,多糖水解程度隨著超聲功率的提高而快速增加。當功率超過270 W后,水解程度則呈現降低趨勢。考慮到本研究采用的超聲系統具有控溫功能,功率優化過程中系統溫度嚴格控制在60 ℃。結合相關參考文獻[28-29],初步推測可能是因為較高的超聲功率會產生較強的空化和剪切效應,使得單糖發生轉化或分解,降低了單糖的含量。所以,最終選擇多糖的超聲功率為270 W。

圖2 超聲功率(A)、溫度(B)和時間(C)對水解程度的影響

2.1.4 水解溫度的影響 如圖2(B)所示,水解程度隨著溫度的變化而發生明顯改變,在30 ℃和50 ℃時,溫度過低,水解程度偏低;當溫度升高到70 ℃時,水解程度大幅度提高,各特征峰的峰面積均出現明顯增加;當溫度繼續升高時,部分單糖發生轉化,導致峰面積降低。因此,選擇70 ℃作為靈芝多糖的水解溫度。

2.1.5 水解時間的影響 如圖2(C)所示,水解時間為0.5 h時,多糖水解不夠充分,產物大部分以多糖形式存在,單糖含量較低;當水解時間增加到1 h時,寡糖和多糖開始水解,單糖含量明顯增加;但當水解時間繼續增加時,單糖含量整體則沒有明顯變化。因此,選擇靈芝多糖的水解時間為1 h。

2.2 色譜條件優化

為了獲得最佳的色譜分離效果和較短的分離時間,對色譜柱類型、流動相組成、柱溫等色譜條件進行了考察。

表1 線性關系考察

在相同的流動相和梯度條件下,考察了Waters XBridge HILIC(2.1 mm×150 mm,2.5 μm)、Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)、MERCK ZIC-HILIC(2.1 mm×150 mm,2.5 μm)三種色譜柱,最終選擇Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)柱作為多糖單糖組成的分析柱。根據7種單糖的保留時間和分離效果,確定乙腈-水(0.8%甲酸)的溶劑體系。糖類為多羥基物質,升高色譜柱溫度可以明顯改善單糖的峰型,但溫度過高又會使得糖類物質發生改性[30],因此選擇柱溫為25 ℃。在優化的色譜條件下,將每種單糖標準品單個進樣分析,和樣品圖進行比對,根據各單糖對照品和樣品的保留時間對各色譜峰進行定性分析。混合對照品及樣品的UPLC-CAD色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品(A)和樣品(B)的UPLC-CAD色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍考察 分別吸取“1.2.3.1”中配好的7種標準品溶液(葡萄糖、巖藻糖、鼠李糖、甘露糖和半乳糖各10.0 μL,阿拉伯糖20.0 μL,木糖30.0 μL)至容量瓶中,充分混勻后稀釋至不同濃度,按“1.2.5”項下色譜條件進樣分析。以各對照品質量濃度的對數為橫坐標(X),以峰面積的對數為縱坐標(Y),繪制標準曲線,結果見表1。由表1可知,7個單糖標準曲線的相關系數均大于0.999,說明其線性關系良好。各單糖標準曲線的線性范圍均在兩個數量級之間,線性范圍較寬。檢出限在0.01～0.17 μg·mL-1之間,說明方法的靈敏度均較高。

2.3.2 儀器精密度試驗 取同一供試品溶液,按“1.2.5”項下色譜條件連續進樣6次,測得7個單糖峰的保留時間RSD分別為0.58%(0.27%)(根據峰1,2的保留時間分別計算,下同)、0.55%(0.55%)、0.80%(0.51%)、0.74%、0.30%、0.62%(0.85%)、0.48%(0.21%),均小于1%;峰面積RSD分別為2.93%(1.31%)(根據峰1,2的峰面積分別計算,下同)、2.62%(1.02%)、1.96%(0.59%)、4.28%、1.29%、2.99%(2.30%)、1.15%(2.21%),均小于5%。結果表明儀器精密度良好。

2.3.3 日間精密度試驗 每日取同一批次粗多糖樣品按“1.2.4”項下方法制成供試品溶液,按“1.2.5”項下色譜條件進樣2次,連續測定3 d,測得7個單糖峰的保留時間RSD分別為0.85%(0.35%)(根據峰1,2的保留時間分別計算,下同)、0.65%(0.31%)、0.08%(0.32%)、0.13%、0.35%、0.46%(0.54%)、0.47%(0.17%),均小于1%;峰面積RSD分別為1.00%(0.08%)(根據峰1,2的峰面積分別計算,下同)、1.05%(0.82%)、0.97%(0.69%)、0.35%、0.94%、1.11%(0.16%)、0.95%(1.64%),均小于5%。結果表明日間精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批次粗多糖樣品,按“1.2.4”項下方法制成6份供試品溶液,按“1.2.5”項下色譜條件進行測定,測得7個單糖峰的保留時間RSD分別為0.60%(0.22%)(根據峰1,2的保留時間分別計算,下同)、0.40%(0.50%)、0.23%(0.16%)、0.15%、0.39%、0.25%(0.46%)、0.23%(0.14%),均小于1%;峰面積RSD分別為3.53%(2.90%)(根據峰1,2的峰面積分別計算,下同)、1.95%(1.56%)、1.18%(2.01%)、3.54%、1.74%、2.43%(1.20%)、1.00%(1.83%),均小于5%。結果表明方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液分別于0、3、6、12、18、24 h按“1.2.5”項下色譜條件進樣分析,測得7個單糖峰的保留時間RSD分別為0.71%(0.24%)(根據峰1,2的保留時間分別計算,下同)、0.40%(0.69%)、0.62%(0.46%)、0.26%、0.80%、0.31%(0.54%)、0.55%(0.21%),均小于1%;峰面積RSD分別為3.50%(2.63%)(根據峰1,2的峰面積分別計算,下同)、2.68%(2.05%)、2.08%(2.15%)、3.92%、3.48%、1.98%(4.10%)、1.99%(1.81%),均小于5%。表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批次粗多糖樣品6份,分別精密加入不同量的鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖對照品適量,使得樣品中所含各單糖量與加入的單糖對照品量之比約為1∶1,按“1.2.2”項下方法進行水解,并按“1.2.4”項下方法制成供試品溶液后按“1.2.5”項下色譜條件進行分析檢測,計算加樣回收率,結果見表2。

表2 加樣回收率試驗(n=6)

續表

2.4 樣品測定

多糖是由10個以上的單糖基和糖苷鍵連接而成的天然生物大分子,其單糖組成分析是基礎性和關鍵性的環節,水解后的單糖組成復雜且含量差異較大。采用本實驗方法對提取的靈芝粗多糖樣品經“1.2.2”項下方法水解后,按“1.2.4”項下方法制成供試品溶液,根據“1.2.5”項下色譜條件分別測定6批次樣品中7種單糖成分的含量。含量測定結果見表3。

表3 粗多糖水解后單糖含量測定結果(mg/g)

其水解后的產物由7種單糖共同組成,其含量分別為:鼠李糖(2.42±0.10) mg/g、巖藻糖(2.19±0.08) mg/g、木糖(27.25±0.67) mg/g、阿拉伯糖(11.99±0.29) mg/g、甘露糖(0.45±0.01) mg/g、葡萄糖(0.85±0.04) mg/g和半乳糖(2.36±0.05) mg/g,含量大小依次為:木糖>阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖>巖藻糖>葡萄糖>甘露糖。摩爾比為:鼠李糖∶巖藻糖∶木糖∶阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=5.90∶5.34∶72.64∶31.96∶1.00∶1.89∶5.24。

3 結論

本研究建立的超聲輔助酸解方法,具有速度快、效率高等顯著優勢,結合UPLC-CAD法可以實現靈芝多糖單糖組成的快速分析測定。對靈芝多糖酸解產物的單糖組成及含量進行分析比較,結果表明:靈芝多糖的完全水解產物中木糖的含量最高,其次為阿拉伯糖,而鼠李糖、半乳糖、巖藻糖含量接近,葡萄糖和甘露糖的含量較低,研究結果為評價靈芝藥材質量及指導進一步開發利用提供了數據支持和技術參考。