白樺BpbZIP1 基因抗旱耐鹽分析及ABRE 元件結合鑒定

郭依萍，石晶靜，周美琪，于 穎，王 超

(林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

持續惡化的自然環境使得植被不斷受到各種各樣的非生物脅迫導致生物量不斷減少。對基因工程研究的不斷深入，使科研人員對植物在抗性方面的研究取得了顯著成就。與植物抗逆相關的基因主要包括可以編碼滲透壓物質的基因、抗氧化基因、編碼保護生物大分子及膜結構蛋白質的基因、編碼轉錄因子的調節基因以及編碼可在逆境中誘導的植物蛋白激酶基因[1]。

堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子（bZIP）普遍存在于真核生物當中，參與多種生物學功能，如植物的生長[2]、損傷修復[3]、逆境脅迫的抵御[4-9]以及病菌的防御[4-5]。

bZIP 轉錄因子結構域含有大約60 到80 個氨基酸殘基，由一個16 至20 個保守氨基酸殘基組成的堿性氨基酸區和一個亮氨酸拉鏈共同組成[10]。保守的堿性氨基酸區含有核定位的信號序列，緊隨其后的是DNA 的識別區域， 該區域可以與特異的DNA 序列相互作用。亮氨酸拉鏈區是一個具有兩親性的α 螺旋[11]，α 螺旋中，每個重復的七肽都包含一個亮氨酸或者其他的疏水殘基。該螺旋結構參與bZIP 蛋白與DNA 結合之前的二聚體化[12]。植物的bZIP 轉錄因子主要存在于細胞核中[13]。

干旱和高鹽等條件下，bZIP 轉錄因子可以與ABFs 和AREBs 結合，從而調控下游的靶基因，ABFs 是元件ABRE 的結合因子，AREBs 是元件ABRE 的結合蛋白，其核心序列為ACGT。擬南芥的抗逆相關基因ICK1、rd29B、rab18、KIN2/KAT2、ADH1、CHS、racS、SUS1 的啟動子區域都發現了ABRE 順式作用元件[14]。Choi 等第一次克隆了擬南芥中的bZIP 轉錄因子，主要包括參與低溫應答反應的ABF1、參與高鹽、干旱等逆境應答反應的ABF2/AREB1、ABF3以及ABF4/AREB2[15]。大豆中鑒定了10 個亞家族共131 個bZIP基因，其中，有近三成bZIP基因可以響應高鹽干旱等逆境脅迫[16]。Liao 等選取其中的4 個GmbZIP基因的過表達載體轉入擬南芥中，發現其均能對逆境脅迫產生相應的應答[17]。Xiang 等鑒定出了水稻中的bZIP基因OsbZIP23，該基因可以顯著提高水稻中的耐旱、耐鹽性[18]。Kranner 等將bZIP 家族中的ThbZIP1基因的過表達載體轉入煙草中，可以提高煙草的部分保護酶（超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD））的活性，以此減少活性氧的數量來有效的克服逆境環境[19]。

白樺（Betula platyphyllaSuk）作為東北地區重要的綠化及用材樹種，鑒定重要抗旱耐鹽基因，研究分子調控機制，具有重要的理論及應用價值。本研究克隆白樺bZIP 轉錄因子，驗證抗旱耐鹽功能，為研究白樺抗非生物脅迫性狀形成的的分子基礎研究及抗性分子育種提供理論數據和研究材料。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

白樺組培苗培養于東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室組織培養室，溫度為25℃，光周期為12 h 光照/12 h 黑暗，光照強度 400 μmol·m－2·s－1。白樺的野生型無菌幼苗作為RNA 提取和過表達載體的瞬時轉化材料。pROKⅡ載體和大腸桿菌（Escherichia coli）Top10、根瘤農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 由實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因克隆及過表達載體構建 RNA 提取試劑盒（Takara，大連）用于提取白樺的總RNA；利用反轉錄試劑盒（Takara，大連）合成cDNA 第一鏈。通過白樺基因組分析及擬南芥抗性bZIP基因同源比對， 確定白樺bZIP基因序列。 利用pROKⅡ質粒的和白樺BpbZIP1基因序列設計引物，其中，pROKⅡ載體SmaⅠ同源序列用下劃線表示出來，如下：bZIP-pROKⅡF′，5′-CTCTAGAGG ATCCCGACAGACCCACCGGGCGATG-3′和bZIP-pROKⅡR′，5′-＞TCGAGCTCGGTACCCCAACGCT AACACCTCCAGCT-3 ′（ 金 唯 智 ， 江 蘇 ） 。 以cDNA 為模板擴增，反應體系如下：正向引物與反向引物各1 μL、模板2 μL、dNTP 4 μL（2.5 mmol·L－1，Takara， 大連）、TransTaqTaq DNA Polymerase High Fidelity（ 2.5 U·μL－1） 0.5 μL、 Buffer 5 μL、去離子水36.5 μL，為50 μL 體系。PCR 的反應程序為94℃預變性3 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸90 s、共35 個循環，72℃延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用膠回收試劑盒（Takara，大連）回收，將回收產物連接到pROKⅡ載體，轉入大腸桿菌Top10，通過篩選送至金唯智測序公司進行DNA 測序。

1.2.2 植物工程菌株的制備 采用液氮法將BpbZIP1-pROKⅡ質粒轉入農桿菌中，通過陽性篩選后保存于－80℃的冰箱中備用。

1.2.3BpbZIP1基因生物信息學分析 根據已發表文獻從擬南芥bZIP 每個亞家族中共選取46 個擬南芥bZIP 蛋白[20]，從NCBI 網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找6 個檉柳bZIP 蛋白，根據BpbZIP1 蛋白序列信息用MEGA5.0 軟件進行進化樹分析。用BioEdit 軟件進行多序列比對分析。

1.2.4BpbZIP1基因GFP 融合表達載體亞細胞定位 利用基因槍介導瞬時轉化法將融合表達載體BpbZIP1-PBI121-GFP 轉化到洋蔥表皮細胞中。使用激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

1.2.5BpbZIP1基因對白樺的瞬時轉化及表達檢測瞬時轉基因方法參照發表文獻進行[21-22]。為檢測基因是否在瞬時轉化株系中表達，根據BpbZIP1基因序列信息設計定量引物，正向引物5′-TC CATGAACATGGACGAGCT-3′，反向引物5′-ATG CTGCCGCTGCGGCAAGC-3 ′ ， 選 擇 β-tubulin和ubiquitin（ GenBank Ac. Num.: HO112154 and FG065618）作為內參基因。進行實時熒光定量PCR 分析[23]，反應體系如下：上下游引物各 1 μL、模板2 μL、去離子水7 μL 和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL（Toyobo Co.，Osaka，Japan）總體系為20 μL，3 次重復，反應程序為94℃預變性3 min，94℃變性12 s、58℃退火30 s、72℃延伸40 s、78.4℃讀板1 s，共45 個循環，72℃延伸7 min。在Bio-Rad Hercules.CA.USA.上完成該反應。讀數分析其數據，運用2－ΔΔCT方法進行相對表達量分析[24]。數據分析采用統計軟件 SPSS17.0（SPSS Inc,Chicago,IL,USA）。利用獨立樣本T檢驗比較處理組和對照組的差異顯著性。

1.2.6BpbZIP1耐鹽抗旱功能分析

1.2.6.1 非生物脅迫下轉基因白樺的組織化學染色 以瞬時轉化過表達載體的植株為實驗組，以瞬時轉化空載體的植株為對照組，分別用水、200 mmol·L－1NaCl 溶液和200 mmol·L－1甘露醇溶液處理，培養48 h 后，剪取大小一致的葉片用于化學染色，利用二氨基聯苯胺（DAB）、伊文思藍（Evans blue）和氮藍四唑（NBT）染色，檢測其活性氧積累及細胞損傷程度。將剩下的植株液氮研磨用于其他生理指標的檢測。

1.2.6.2 非生物脅迫下轉基因白樺的生理指標分析 將液氮研磨后的樣品用植物組織銅鋅-超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（建成生物工程研究所，南京）測定轉基因和對照株系SOD 活性。利用過氧化物酶（POD）測試盒（建成生物工程研究所，南京）測定轉基因和對照株系POD 酶活。

1.2.7 結合元件分析 根據已發表數據選取ABRE順式作用元件（ACGTGGC）作為主要研究對象，利用酵母單雜交實驗[25-26]進行轉錄因子與ABRE元件及6 個突變元件的結合驗證。

2 結果與分析

2.1 BpbZIP1 基因的克隆

通過白樺基因組數據分析及擬南芥抗性相關bZIP基因同源比對分析，鑒定了一條白樺bZIP基因，該基因完整的開放讀碼框（ORF）共有1 269個堿基，總共編碼422 個氨基酸殘基，將其命名為BpbZIP1。以野生型白樺cDNA 為模板，使用特異性的基因引物bZIP-pROKⅡF’和bZIP-pROKⅡR’，利用RT-PCR 對其進行克隆，擴增出含載體同源序列的大小的目的片段（圖1）。目的片段連接到pROKⅡ載體上并轉化至大腸桿菌中，選取陽性單克隆進行菌液PCR 驗證，并進行測序，測序結果與序列一致，說明成功克隆獲得BpbZIP基因。

2.2 BpbZIP1 基因的生物信息學分析

將BpbZIP1 蛋白序列與擬南芥和檉柳中多條蛋白序列進行比對，結果（圖2）表明：BpbZIP1蛋白與擬南芥AtbZIP12、AtbZIP67、AtbZIP14 和AtbZIP27 進化關系較近，其中，與BpbZIP1 蛋白親緣關系最近的AtbZIP12 蛋白在非生物脅迫中起到重要作用[27]，推測出BpbZIP1 蛋白也可能具有抗逆作用。

將BpbZIP1 蛋白與進化樹中進化關系較近的AtbZIP12、AtbZIP14 和AtbZIP27[20]進行多序列比對，結果（圖3）表明：比對得出很多相似的保守區，用紅色框標出，其中，含有堿性亮氨酸拉鏈域的用藍色框標出。

圖1 BpbZIP1-pROKⅡ載體菌液PCR 驗證結果Fig. 1 PCR verification of BpbZIP1-pROKⅡ vector

2.3 氯化鈉和甘露醇脅迫下BpbZIP1 基因的表達

為檢測BpbZIP1基因是否對鹽和旱脅迫應答，通過實時定量分析了白樺野生型中BpbZIP1基因在受到甘露醇和NaCl 脅迫不同時間梯度后的表達模式，結果（圖4）表明：在NaCl 脅迫時，BpbZIP1基因在6、12 、24 h 時白樺體內的相對表達量相對較低，在脅迫48 h 時高度誘導表達；在甘露醇脅迫時，表達變化不明顯。說明BpbZIP1基因響應NaCl 脅迫，干旱脅迫響應較弱。

2.4 亞細胞定位

用pBI121-GFP 質粒做為對照組，轟擊洋蔥表皮細胞后進行暗培養，利用激光共聚焦顯微鏡觀察轉化后洋蔥表皮細胞，實驗結果（圖5）表明：對照在細胞膜以及細胞核內均含有綠色熒光，BpbZIP1-PBI121-GFP 只有在洋蔥表皮細胞核中有綠色熒光的出現，與DAPI 核染色位置一致，說明BpbZIP1轉錄因子定位在細胞核中。

2.5 瞬時轉基因白樺株系的獲得

利用農桿菌介導的瞬時轉化法，能夠快速篩選鑒定基因功能。本研究將BpbZIP1-pROKⅡ表達載體瞬時轉化白樺，利用實時熒光定量PCR 檢測轉基因效率，結果（圖6）顯示：在轉基因白樺中，BpbZIP1基因的表達量明顯高于野生型對照白樺植株，驗證檢測出的過表達的陽性株系用于之后的非生物脅迫相關實驗。

2.6 BpbZIP1 轉基因白樺抗旱耐鹽性分析

圖2 BpbZIP1 與其他物種bZIP 蛋白進化分析Fig. 2 Evolution analysis of BpbZIP1 and other bZIP proteins

2.6.1 非生物脅迫下轉基因白樺的組織化學染色結果 在對白樺野生型進行BpbZIP1基因的瞬時轉化之后，以轉化pRKOⅡ空載體的白樺為參照，根據著色程度可以鑒別白樺細胞的損傷情況及活性氧積累，實驗結果（圖7）表明：在沒有進行非生物脅迫（對照組）時，BpbZIP1 轉基因株系和野生型對照（WT）基本著色淺且相互之間無明顯差異，說明細胞損傷程度基本相同。在NaCl 和甘露醇脅迫下，白樺的著色不同程度的加深，BpbZIP1 基因的過表達株系葉片的DAB、NBT 和Evans blue 著色淺于野生型對照，說明轉基因株系葉片在脅迫處理下，活性氧積累少于野生型對照，細胞損傷程度較低，可以初步證明BpbZIP1 基因能夠提高轉基因白樺的抗逆能力。

2.6.2 非生物脅迫下轉基因白樺的生理生化指標分析

2.6.2.1 SOD 活性測定 從圖8 可以看出：在NaCl和甘露醇的非生物脅迫下，轉BpbZIP1基因株系和WT 的SOD 活性發生了變化，BpbZIP1 基因的過表達株系SOD 活性高于WT，說明BpbZIP1 轉基因株系的脅迫抗逆能力較WT 的植株強。實驗結果進一步表明，BpbZIP1 基因在白樺體內有一定的抗逆作用。

2.6.2.2 POD 活性測定 從圖9 可以看出：在NaCl 和甘露醇的非生物脅迫下，BpbZIP1 轉基因株系和WT 的POD 活性發生了變化，NaCl 脅迫下，BpbZIP1 基因的過表達株系POD 活性高于WT，甘露醇脅迫變化不明顯，說明BpbZIP1 轉基因植株在鹽脅迫下，保護酶活性高于WT，轉基因植株的耐鹽能力在一定程度上有所提高。實驗結果進一步表明，BpbZIP1基因在白樺體內有一定的耐鹽作用。

圖3 BpbZIP1 與bZIP 蛋白序列比對結果Fig. 3 Multiple alignment analysis of BpbZIP1 and bZIP protein sequences

圖4 BpbZIP1 基因響應鹽、旱脅迫分析Fig. 4 Analysis of BpbZIP1 Gene response to salt and drought treatments

2.7 BpbZIP1 與ABRE 元件結合分析

2.7.1 BpbZIP1-pGBKT7 載體轉錄激活檢測 將BpbZIP1-pGBKT7 質粒和作為對照的pGBKT7 空載體轉化Y2H 酵母感受態，將稀釋后的菌液依次涂布在培養基SD/-Trp、SD/-Trp/-His/X-a-Gal、SD/-Trp/-His /-Ade /X-a-Gal 上，培養箱倒置培養（30℃/3 d）。BpbZIP1-pGBKT7 能在一缺培養基上生長，但是在二缺和三缺培養基上不生長。挑取一缺培養基上菌體加入到一缺液態培養基中震蕩培養，將適量菌液接種在三缺培養基（含X-a-Gal）上，30℃培養后發現， BpbZIP1-pGBKT7 沒有藍斑出現（圖10），說明BpbZIP1基因全長序列不具有轉錄激活活性。

圖5 BpbZIP1 轉錄因子亞細胞定位Fig. 5 Subcellular localization of BpbZIP1 transcription factor

圖6 過表達轉基因白樺植株BpbZIP1 基因的表達量分析Fig. 6 Analysis of the expression levels of transgenic B.platyphylla plants

圖8 非生物脅迫下轉基因白樺株系SOD 活性分析Fig. 8 SOD activity of transgenic B. platyphylla lines under abiotic stress

圖9 非生物脅迫下轉基因白樺株系POD 活性分析Fig. 9 POD activity of transgenic B. platyphylla lines under abiotic stress

圖10 BpbZIP1 轉錄激活驗證Fig. 10 Transcription activation verification of BpbZIP1

2.7.2 BpbZIP1 轉錄因子與ABRE 元件結合 將ABRE-pHIS2 和pHIS2-AM1-6 突變載體分別同BpbZIP1-pGADT7 載體共轉化Y187 酵母細胞，在篩選之后將一缺培養基上的菌體于一缺液態培養基內震蕩培養，后經不同稀釋倍數后，依次接種于加入30 mmol·L－13-AT 的二缺和三缺培養基上，培養4 d后長出菌點。結果（圖11）表明：在二缺培養基上除了陰性對照，ABRE 元件與其6 個突變元件長出正常的菌點，而三缺培養基（30 mmol·L－13-AT）上突變元件則無法長出菌點，表明BpbZIP1轉錄因子能夠與ABRE 順式作用元件結合。

圖11 BpbZIP1 與ABRE 元件結合分析Fig. 11 Binding analysis between BpbZIP1 and ABRE element

3 討論

本研究鑒定的bZIP 轉錄因子，具有該家族結構域的典型特征[28]。系統進化和功能分析證實BpbZIP1基因與擬南芥親緣關系相近的bZIP基因在非生物脅迫中起到相似的作用。BpbZIP1在NaCl脅迫了48 h 時表達量大幅上調，說明該基因能夠響應鹽脅迫；但鹽脅迫后，該基因先下調后上調的表達模式，可能與植物適應外界環境以及自身保護機能的衰退有關[29]。在甘露醇脅迫時，BpbZIP1 表達變化則不明顯，該基因的抗旱功能有待更多的試驗證據來確定。

瞬時轉化法是快速確定基因功能的有力工具[21-22]。本研究利用農桿菌介導的瞬時轉化法，分析BpbZIP1 基因在白樺轉基因株系中的耐鹽抗旱能力。植物細胞中的H2O2能釋放出氧化DAB 的氧離子，產生棕色的沉淀，細胞受損傷越嚴重，H2O2釋放的量越多，染色的顏色也就越深，所以，可以根據顏色深淺判斷細胞的損傷程度。本研究利用NaCl 鹽和甘露醇處理模擬鹽和干旱脅迫，分析轉基因株系耐鹽抗旱性[30]，并進行了組織化學染色和生理指標檢測，結果發現，轉基因株系和野生型在活性氧積累和保護酶活性指標上發生了變化。實驗結果顯示，轉基因株系受到脅迫后，過表達株系DAB 染色的顏色比野生型顏色淺，說明過表達株系中H2O2積累低于野生型。Evans blue 染色的顏色較野生型淺，說明轉基因株系細胞損傷程度小。植物體的超氧化物歧化酶可以抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用。NBT 染色結果也顯示，轉基因株系細胞內超氧離子的積累少于野生型。綜上所述，組織化學染色結果顯示：BpbZIP1基因的過表達株系較野生型受鹽害程度低，BpbZIP1基因在白樺轉基因體內起一定的抗逆作用。

保護酶能有效地保護植物細胞免受損傷[31]。SOD 和POD 是細胞內清除過量活性氧的重要酶促系統[32]。當植物受到脅迫時，體內的SOD 和POD含量增高，以便較快地清除植物體內的自由基，從而降低植物受傷的程度[33]。本實驗中，保護酶活性分析同樣印證了組織化學染色的結果。當植物受到甘露醇和NaCl 脅迫時，轉基因植株中的SOD 和POD 含量都高于野生型，說明轉基因植株受到脅迫時，細胞內保護酶含量增高，從而減少損傷。在轉BpbZIP1 基因白樺體內，抗逆性可能是通過保護酶系統發揮作用的。相反，在甘露醇脅迫下，轉基因植株所測定的各項指標都較野生型植株變化不明顯。在基因表達分析結果中也顯示，該基因受干旱脅迫誘導不明顯，說明該基因主要具有耐鹽功能。

bZIP 轉錄因子可以與抗逆相關的順式作用元件（如ABRE 元件、G-box 元件以及w-box 元件）相互作用，調控下游基因的表達。本研究驗證了BpbZIP1 能夠與ABRE 順式作用元件相結合，為研究白樺抗非生物脅迫性狀形成的分子基礎及林木抗性分子育種提供理論數據和研究材料。

4 結論

克隆獲得白樺BpbZIP1 基因，該基因蛋白序列與已知抗性相關基因AtbZIP12 蛋白序列聚為一組，定位于細胞核中表達；BpbZIP1 基因受NaCl處理的誘導；BpbZIP1 基因能夠通過清除活性氧，減輕細胞損傷來提高白樺瞬時轉化株系的耐鹽能力，抗旱能力不明顯；BpbZIP1 能夠與逆境相關ABRE 元件特異性結合。本研究鑒定出具有耐鹽功能的白樺BpbZIP 轉錄因子及其結合元件，為進一步分析白樺bZIP 基因的耐鹽分子調控機制及白樺耐鹽分子育種提供基礎數據和材料。