不同品種油茶根際叢枝菌根真菌群落結構特征

林宇嵐，李正昀，吳 斐，裴 蘊，張 揚，張林平，楊 瀅，譚明曦

(江西農業大學 鄱陽湖流域森林生態系統保護與修復國家林業和草原局重點實驗室，江西 南昌 330045)

油茶（Camellia oleifera Abel.）又稱茶子樹，屬于山茶科、山茶屬植物，是我國南方丘陵地區重要的木本油料樹種[1]。油茶籽所榨茶油中含有大量不飽和脂肪酸，具有降低血脂、降低膽固醇、保護心血管系統等功效[2]。此外，油茶也是防風固沙和保持水土的重要樹種[3]。截止2017 年底，我國油茶種植面積已擴大到443 萬多hm2[4]。然而，在油茶林經營過程中，大量不合理施肥已造成生態環境質量下降，引起的土壤重金屬含量過高、土壤環境酸化板結等問題日益突出[5]。因此，提高化肥利用效率，降低施用量，恢復退化土壤已成為我國油茶產業可持續發展突出問題。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizas，AM）真菌，作為一種廣泛存在于陸地生態系統的共生菌，能夠改善植物對磷、氮等養分的吸收，提高植物對生物和非生物逆境的抗性[6]。隨著人們對作物生產中高產、資源高效意識的不斷提高，AM 真菌在集約化作物生產體系中的作用日益受到關注[7]。AM 真菌的生理生態功能與其群落結構密切相關，不同的AM 真菌群落通常具有不同的功能[8-9]。植物種類是影響AM 真菌群落結構特征的重要因素[10]。大量研究發現，在物種水平上，同一生境下共存的不同植物，其共生的AM 真菌種類明顯不同[11]。少量有關同一植物不同品種AM 真菌群落組成的研究表明，AM 真菌的群落組成受到寄主植物基因型的影響[11]。郭邵霞和劉潤進[8]研究發現，牡丹基因型能改變AM 真菌的侵染率和種屬組成。Mao 等人[12]發現，不同品種小麥AM 真菌侵染率相同但群落組成不同。近年來，人們不斷地篩選和培育出具有優良性狀的作物新品種，并應用于生產，因此，開展同一植物不同栽培品種AM 真菌群落組成的研究具有一定的理論研究和實際應用意義。

目前，關于油茶根際AM 真菌種類已有相關報道[5]，然而，對不同品種油茶根際AM 真菌的多樣性是否存在差異未見報道。為此，本研究以不同品種油茶根際土壤為研究對象， 采用Illumina MiSeq 高通量測序技術研究油茶不同品種AM 真菌多樣性，并分析AM 真菌群落特征與土壤理化性質間的關系，為油茶專用菌肥研發和集約化可持續經營提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣地和根際土壤采集

油茶根際土壤取自江西省宜春市袁州區江西星火農林公司油茶種植基地（27°43′ N，114°11′E），該基地屬典型亞熱帶季風氣候，年降水量1 595.8 mm，年平均氣溫16.4 ℃，土壤類型為紅壤。選取的長林3（CL3）、長林4（CL4）、長林53（ CL53）、 贛無84-8（ GW84-8）、 贛興48（GX48）5 個品種均為5 年生油茶，每個品種生態環境條件一致，且經營管理措施相同，種植密度為2 m×3 m。每個品種油茶林中隨機劃定5 個樣地，每個樣地隨機選取長勢相似的油茶5 株。去除土壤表面枯落葉層，在距植物主干50 cm 的東南西北4 個方位，采集0～20 cm 的油茶根系，在無菌自封袋中輕輕抖動根系，收集根系上的土壤，作為根際土，將同一樣地5 株植物根際土壤混合均勻，5 個樣地作為重復，共計25 個土壤樣品，將土樣編號裝入自封袋運回實驗室并分為兩份，1 份在－80 ℃條件下冷凍保存，用于DNA 提取及高通量測序；另一份土樣避光風干保存，用于測定土壤理化性狀。

1.2 土壤理化分析

AM 真菌侵染率測定采用臺盼藍（ Trypan blue）染色法[13]和顯微十字交叉法[14]進行觀察統計；土壤理化性質測定方法具體參照魯如坤主編《土壤農業化學分析方法》[15]，土壤含水率測定采用烘干法；土壤pH 采用電位法；土壤全氮、全磷采用HClO4-H2SO4消化法；銨態氮采用靛酚藍比色法測定；硝態氮用鍍銅鎘還原-重氮化偶合比色法測定；有效磷測定采用氟化銨-鹽酸浸提法；有機質采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）測定。

1.3 高通量基因組測序方法

油茶根際土壤總DNA 的提取使用土壤基因組DNA 抽 提 專 用 試 劑 盒 （ 購 自MP biomedicals 公司），利用瓊脂糖電泳檢測DNA 的完整性。采用AMV4.5NF（ 5 ′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3 ′）/ AMDGR（ 5 ′-CCCAACTATCCCTATTAATC AT-3′）引物對AM 真菌rDNA 進行PCR 擴增，利用illumina 高通量測序儀（Illumina MiSeq）測序平臺進行測序，下機數據通過QIIME（v1.8.0）剔除問題序列。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析[16]，用鄧肯檢驗（Duncan’s test）進行分析和差異顯著性檢驗。采用R 軟件，用非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling, NMDS） 檢驗AM真菌屬水平群落組成結構[17]；用Mothur[18]軟件對屬水平的各個分類單元在品種之間的序列量差異進行兩兩比較檢驗。使用QIIME[19]軟件計算Alpha多樣性指數[ 主要包括辛普森指數（simpson）、Chao 1指數、ACE 指數和香農指數（shannon）]，并進行多元方差分析和置換檢驗（Adonis/ Permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）。利用R 軟件的冗余分析（Redundancy analysis, RDA）描述根際AM 真菌豐富度最高的5 個屬和土壤因子間的關系。采用Origin Pro 8.5 軟件進行繪圖（http://www.originlab.com/）。

2 結果與分析

2.1 AM 真菌侵染率

AM 真菌對5 個品種油茶的主要侵染類型均為菌絲侵染，不同品種油茶AM 真菌的侵染率存在差異（圖1）。GX48 的總侵染率最高，GW84-8的總侵染率最低。5 個品種的菌絲侵染率變化規律與總侵染率基本一致。CL4 和CL53 的泡囊侵染率高于其他品種。CL4 的叢枝侵染率高于其他品種。

2.2 AM 真菌群落組成

對5 個不同品種油茶根際土壤進行高通量測序，共獲得1 376 048 條高質量序列，所有序列共歸為2 538 個OTUs，其中CL4、GW84-8、GW48、CL3、CL53 中包含的OTU 數目分別是830、931、1 163、1 103、1 012 個。5 個品種共有OTUs 為176 個，其中不同品種特有OTU 數目分別是237、196、259、306、201 個。總體來看，不同品種油茶根際土壤共有的微生物數量較少。

圖1 油茶不同品種根系AM 真菌侵染率Fig. 1 Infection rate of AM fungi in roots of different cultivars of Camellia oleifera

對OTUs 從門到屬依次進行分類，總共獲得AM 真菌群落1 門、 1 綱、 4 目、 10 科、 12 屬（表1），即為球囊菌門Glomeromycota 和球囊菌綱Glomeromycetes， 4 個目分別為球囊霉目Glomerales（ 占總數的62.40%）、 類球囊霉目Paraglomerales（ 25.32%） 、 原 囊 霉 目Archaeosporales（ 4.28%） 、 多 樣 孢 囊 霉 目Diversisporales（0.98%）；在科水平，5 個油茶品種根際中共鑒定出10 個科， 其中球囊霉科Glomeraceae（占總數的41.12%）、類球囊霉科Paraglomeraceae（ 25.32%） 、 近 明 球 囊 霉 科Claroideoglomeraceae（21.28%）等相對豐度較高，而原囊霉科Archaeosporaceae（2.22%）、雙型囊霉 科Ambisporaceae（ 2.05%） 、 無 梗 囊 霉 科Acaulosporaceae（ 0.57%） 、 巨 孢 囊 霉 科Gigasporaceae（ 0.33%） 、 多 樣 孢 囊 霉 科Diversisporaceae（ 0.07%） 、 和 平 囊 霉 科Pacisporaceae（ 0.02%） 、 地 管 囊 霉 科Geosiphonaceae（0.01%）等相對豐度較低。

2.3 油茶不同品種AM 真菌屬水平分類學組成及豐度

不同品種油茶根際AM 真菌群落組成不同，其中從CL4、CL53 根際土壤中均檢測到12 個屬，而GW84-8、CL3、GX48 中分別檢測到11、10、9 個屬（圖2）。球囊霉屬Glomus、類球囊霉屬Paraglomus、巨孢囊霉屬Gigaspora 和近明球囊霉屬Claroideoglomus 的相對豐度在5 個油茶品種間具有顯著差異（圖2）。與其他品種相比，GW84-8 中球囊霉屬Glomus 相對豐度（71.49%）最高，而類球囊霉屬Paraglomus（6.70%）和巨孢囊霉屬Gigaspora（0.02%）相對豐度最低；CL53 中近明球囊霉屬Claroideoglomus相對豐度（34.12%）最高，而巨孢囊霉屬Gigaspora相對豐度（0.18%）最低。

表1 油茶根際土壤AM 真菌群落系統分類 Table 1 Taxonomy of AM fungal communities in rhizosphere soil of Camellia oleifera

圖2 油茶不同品種根際土壤AM 真菌屬水平分類單位組成及豐度Fig. 2 Taxonomic composition and distribution abundance of the AM fungal genera in rhizosphere soil of different cultivars of Camellia oleifera

2.4 AM 真菌群落多樣性分析

不同品種油茶AM 真菌α 多樣性分析結果如表2 所示，5 個品種油茶根際土壤AM 真菌的辛普森指數、Chao 1 指數、ACE 指數和香農指數均無顯著差異，說明品種對油茶根際AM 真菌多樣性影響不大。

2.5 AM 真菌群落結構的相似性分析

不同品種油茶根際土壤AM 真菌β 多樣性分析結果如圖3 所示，第一軸從左至右的梯度基本代表品種從CL53 到CL3 排列，代表梯度比較短，第二軸從上至下的梯度代表品種從CL53 到CL4 排列，代表梯度較短。從品種分布來看，GW84-8 和GX48 分布較集中，而CL3、CL4 和CL53 分布較發散，表明CL3、CL4 和CL53 群落結構差異較大，而GW84-8 和GX48 差異較小。Adonis 分析結果表明，油茶5 個品種的AM 真菌屬水平上的群落結構存在顯著差異（P＜0.05）。

表2 油茶不同品種根際土壤AM 真菌α 多樣性指數 Table 2 Alpha diversity index of AM fungi in the rhizosphere soil of different cultivars of Camellia oleifera

圖3 油茶不同品種根際土壤AM 真菌屬水平群落結構NMDS 分析Fig. 3 NMDS analysis of community structure of AM fungi in rhizosphere soil of different cultivars of Camellia oleifera

2.6 AM 真菌群落組成與土壤因子的RDA 分析

RDA 分析表明，土壤因子對AM 真菌群落變異的解釋量超過30.13%，第一排序軸解釋群落變化的16.91%， 而第二排序軸解釋群落變化的13.22%（圖4）。硝態氮對AM 真菌群落結構有顯著影響（P＜0.05）。其中，類球囊霉屬Paraglomus、巨孢囊霉屬Gigaspora、原囊霉屬Archaeospora、多樣孢囊霉屬Diversispora、 無梗囊霉屬Acaulospora、隔球囊霉屬Septoglomus和地管囊霉屬Geosiphon豐度與硝態氮正相關，而雙型囊霉屬Ambispora豐度與硝態氮負相關。

3 討論

圖4 油茶不同品種根際土壤AM 真菌屬水平群落及土壤理化因子的RDA 分析Fig. 4 RDA analysis of genus-level communities and soil properties of AM fungi in rhizosphere soil of different cultivars of Camellia oleifera

地球陸地上絕大多數植物都能與AM 真菌形成菌根，AM 真菌的生長發育和完成生活史離不開寄主植物[20]。本研究結果表明5 個不同品種油茶均能與AM 真菌形成共生體，AM 真菌總侵染率介于20.61%～43.07% 之間，平均侵染率為34.10%，屬于中度侵染。各油茶品種間的AM 總侵染率、菌絲侵染率、泡囊侵染率及叢枝侵染率均有顯著差異， 表明在本試驗系統中， 油茶品種是影響AM 真菌侵染率的重要因素，這與前人的一些研究結論一致，如Steinkellner 等人[21]對10 個品種番茄的AM 侵染率進行研究，發現番茄品種顯著影響AM 真菌的侵染率；郭紹霞等[8]研究表明牡丹品種會影響到AM 真菌侵染率和種屬構成。同一植物不同品種的生理生化特性不同，根系生理代謝和分泌物組成含量的差異可能影響AM 真菌對植物根系的識別和侵染強度[12]。

運用高通量測序技術對5 個不同品種油茶根際土壤AM 真菌進行檢測，結果表明油茶根際土壤共有AM 真菌12 個屬，相對豐度前3 的屬分別為球囊霉屬Glomus（ 41.053%）、 類球囊霉屬Paraglomus（ 25.323%） 、 近 明 球 囊 霉 屬Claroideoglomus（21.276%），其中Glomus 屬是油茶林AM 真菌中分布范圍最廣的屬，這與鄧小軍等[5]、蘇琍英等[22]研究結論一致；而劉輝等[23]在茶樹中共分離鑒定出8 屬36 種AM 真菌，其中Acaulospora、Glomus、Funneliformis 為 豐 度 較 高的前三個屬，上述結果表明AM 真菌對寄主植物有一定的偏好性。本研究中，5 個品種油茶根際分別鑒定出9～12 個屬AM 真菌，且AM 真菌的辛普森指數、Chao 1 指數、ACE 指數和香農指數均無顯著差異，表明品種對油茶根際土壤AM 真菌豐富度和多樣性的影響不明顯； 由于Glomus、Paraglomus、Gigaspora 和Claroideoglomus 等屬在不同品種中的相對豐度存在差異，因此造成了不同品種油茶的AM 真菌群落結構的變化，與郭邵霞等[8]、Mao 等人[12]研究結果一致。植物種類是影響AM 真菌群落結構的重要的因子[24]，不同植物和同一植物不同品種遺傳物質并不相同，可能由于根系形態結構、分泌物等差異，能促進或抑制某些AM 真菌的生長發育，進而影響到植物AM 真菌群落結構特征。

在陸地生態系統中，土壤類型、土壤肥力、土壤pH 值等土壤因子都會對AM 真菌群落組成和分布有重要影響[25-28]。Matev?等人[29]認為有效磷是影響葡萄園AM 真菌群落變化的主要原因之一；Guo 等人[30]認為土壤pH 是影響AM 真菌多樣性的最主要土壤因子，可能是由于其能夠直接影響AM真菌生理狀態，改變其生態位，并通過調節土壤養分的生物有效性等間接影響AM 真菌群落；而鄧小軍等[5]在研究中發現油茶AM 真菌豐度與全氮、有機質顯著正相關。在本研究中，我們發現硝態氮是影響油茶根際AM 真菌群落組成與分布的最主要因素，這可能是因為硝態氮在土壤中移動性較強，能夠通過質流被植物吸收，并改變土壤養分平衡和時空特性，從而間接地影響AM 真菌群落[31]。AM 真菌的群落組成是其生理生態功能的基礎[9]，這些AM 真菌群落結構的差異是否影響其功能還有待進一步研究。

4 結論

AM 真菌是陸地生態系統中重要的微生物之一，本研究研究了5 個不同品種油茶根際AM 真菌群落的多樣性及其群落結構特征，結果表明，油茶根際土壤中AM 真菌資源較為豐富，5 個不同品種油茶根際土壤AM 真菌多樣性無顯著差異，而油茶品種對AM 真菌群落結構有顯著影響，且硝態氮是影響油茶根際AM 真菌群落組成和分布的主要土壤因子。