貯藏溫度對楓香種子耐貯性的影響

裴云霞，曹 健，杜克兵＊，管蘭華，張 銳，蔣祥娥，蔡 桁，倪天虹

(1. 華中農業大學園藝林學學院/湖北林業信息技術研究中心,湖北 武漢 430070；2. 湖北省林業廳林木種苗管理總站,湖北 武漢 430079)

楓香（Liquidambar formosana Hance）系金縷梅科（Hamamelidaceae）楓香樹屬的高大喬木，是我國重要的鄉土樹種，主要分布于淮河、長江流域以南地區。由于其生長迅速，抗逆性強，木材優良，秋葉紅色鮮艷，成為我國亞熱帶地區重要的用材林、生態林造林樹種和秋色葉觀賞樹種。播種是楓香繁殖的一種重要方法。楓香種子一般于10—11 月成熟，由于種子較小，多進行春播繁殖。為保障種子發芽率和苗木質量，采種后多需要進行貯藏，以保持種子活力與品質[1-2]。已有研究表明，種子含水量與貯藏溫度對其耐貯性有較大的影響，且種子類型不同，適宜的含水量與貯藏溫度亦有所不同[3-4]。如油脂含量高的花生和大豆種子，含水量為5% 時在－18℃的環境下貯藏效果較好；淀粉類種子（如玉米），當含水量為8% 時適合超低溫貯藏[5-7]。目前，關于楓香種子的形態特征、成熟性狀[8]、種子成分[9]、種子萌發特性[10]、播種育苗技術[11-13]等已有較多的報道，但涉及楓香種子貯藏方面的研究還較少，其耐貯性及適宜的貯藏條件尚不明晰。鑒于此，本文以楓香種子為材料，研究不同貯藏溫度對種子活力的影響，以期了解楓香種子的耐貯性，為楓香種子的科學貯藏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試楓香種子于2017 年12 月初采于江西廬山。采種時，隨機選擇生長健壯、結實量大、無明顯病蟲害的優良單株作為采種母樹。采種母樹共15 株（胸徑20～30 cm），將其球果曝曬4 d 后收集種子。種子去除雜質，均勻混合后作為試驗材料。

1.2 試驗方法

種子采集后，首先測定新鮮種子的千粒質量。然后，將種子于室內自然陰干至含水量為10.54%。12 月中旬開始種子貯藏試驗。將種子隨機分為12 份，分別置于4 個不同溫度條件下進行貯藏。貯藏溫度設置為室溫（25±2）℃、4℃、－20℃和－70℃，每個溫度3 份種子（即3 次重復）。于貯藏0、60、180、300、360、520、730 d 時分別測定種子的丙二醛含量和相對電導率，并將種子于室內播種，測定發芽勢、發芽率及播種1 個月后萌發幼苗的苗高和根長。各指標的具體測定方法如下：

1.2.1 千粒質量

采用四分法取樣，測定100 粒種子質量（百粒質量），然后換算成千粒質量，4 次重復[14]。

1.2.2 含水量 稱取一定量的種子（濕質量），105℃殺青2 h，然后65℃烘干至恒質量，稱質量（干質量），4 次重復。種子含水量=（種子濕質量－種子干質量）/種子濕質量×100%。

1.2.3 發芽勢與發芽率 貯藏過的種子在播種前于室溫下在飽和水蒸汽中（100% 相對濕度 RH）回濕2 h。隨后，用0.3% 高錳酸鉀消毒2 h，清水漂洗3 次，然后于室溫下浸泡24 h，去除浮粒后采用培養皿進行發芽試驗[15]。首先，在培養皿內墊5 層濾紙，將濾紙用蒸餾水潤濕，但無明顯積水。隨后，將其置于（25±2）℃培養，每天16 h 光照，8 h 黑暗，3 次重復，每重復50 粒種子，培養皿完全隨機排列。發芽試驗第5 天，統計種子發芽勢。發芽勢=培養5 d 后的發芽種子數/播種種子數×100%[16]。發芽試驗第15 天（此時種子萌發全部結束），統計種子發芽率。發芽率=培養15 d 后的發芽種子數/播種種子數×100%。

1.2.4 苗高與根長 自發芽試驗第15 天開始，給萌發的幼苗澆1/2MS 營養液，每周3 次，至第30 天時用直尺測定幼苗的苗高與根長。苗高為根莖至幼苗頂芽之間的長度；根長為根莖至主根根尖的長度。

1.2.5 丙二醛含量 貯藏期間，測定種子的丙二醛（MDA）含量，評價種子膜脂過氧化程度和劣變程度。具體方法如下：分別取種子0.5 g（W），加入5 mL 0.9 g·L－1NaCl 溶液，研磨后所得勻漿在3 000 r·min－1下離心10 min。取上清液1 mL，加入2 mL 0.67%TBA，充分混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷卻后再離心1 次，分別測定上清液在450、532、600 nm 處的吸光度, 以0.67%TBA 為對照，計算MDA 濃度（μmol·g－1），3 次重復。

MDA 濃度=(6.45×(OD532－OD600)－0.56×OD450)×0.03/W[17]

1.2.6 相對電導率 貯藏期間，測定種子的相對電導率，評價細胞膜受損程度和種子劣變程度。試驗方法如下：稱取種子2 g，用蒸餾水快速清洗3 次，用濾紙吸干種子表面水分。隨后，將清洗過的種子放入50 mL 離心管中，添加20 mL 蒸餾水，于25℃下浸種24 h 后測定電導率EC1。隨后，將種子置于100℃沸水浴15 min，自然冷卻10 min 后再測定電導率EC2，3 次重復。

相對電導率= EC1/ EC2×100%[17]

1.2.7 數據分析 對發芽勢、發芽率、MDA 含量、相對電導率、苗高與根長等指標進行方差分析（ANOVA）與多重比較（Duncan’s），評價不同處理間的差異顯著性，其中，發芽率、發芽勢、相對電導率的數據經過反正弦轉換后再用于方差分析。

2 試驗結果

2.1 貯藏溫度對種子發芽率的影響

試材楓香種子的千粒質量為39.6 g。貯藏試驗開始時（0 d），含水量為10.54%，發芽率為77.0%。

方差分析顯示，貯藏溫度（ANOVA，3 df，F=3.17，p＜0.05）、時間（ANOVA，6 df，F=5.77，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18 df，F=6.19，p＜0.05）均對種子的發芽率有顯著影響（圖1）。貯藏180 d 時，4 種溫度下種子發芽率的變化幅度均較小，不同溫度相互之間差異不顯著；隨著貯藏時間的延長，不同溫度之間發芽率的差異逐漸加大；至520 d 時，室溫下的發芽率最低，－70℃最高，4℃與－20℃介于中間，二者之間差異不明顯；至730 d 時，4 種溫度下發芽率的排序與520 d時一致，但不同溫度之間的差異進一步增加。此時，室溫、4℃、－20℃和－70℃條件下的發芽率分別為51.33%、71.33%、70.0% 和78.67%，相比于0 d 時的發芽率，分別降低25.67%、5.67%、7.00%和－1.67%。可見，楓香種子在含水量為10.54% 時，低溫（4℃、－20℃）和超低溫（－70℃）的貯藏效果明顯優于室溫，其中，－70℃的貯藏效果最好。

圖1 不同貯藏溫度下種子發芽率隨時間的變化趨勢Fig. 1 Changes of seed germination rates with time at different storage temperatures

2.2 貯藏溫度對種子發芽勢的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F=161.39，p＜0.05）、時間（ANOVA，6df，F=38.83，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18df，F=49.75，p＜0.05）均對楓香種子的發芽勢有顯著影響（圖2）。貯藏0 d時，種子的發芽勢為62.67%；至360 d 時，4 個溫度下種子的發芽勢均無明顯變化，且不同溫度之間的差異不明顯；貯藏至520 d 時，－70℃、－20℃和4℃條件下種子的發芽勢變化仍不明顯，而室溫條件下的發芽勢明顯降低；至730 d時，－70℃、－20℃和4℃條件下種子的發芽勢略低于0 d 時的發芽勢，而室溫條件下的發芽勢顯著降低。此時，室溫、4℃、－20℃和－70℃的發芽勢分別為5.0%、54.67%、52.00% 和61.33%，與0 d 相比分別降低57.67%、8.00%、10.67% 和1.34%，這與發芽率的結果一致。

圖2 不同貯藏溫度下種子發芽勢隨時間的變化趨勢Fig. 2 Changes of seed germination potential with time at different storage temperatures

2.3 貯藏溫度對幼苗苗高的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F=4.31，p＜0.05）、時間（ANOVA，6df，F=6.39，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18df，F=11.25，p＜0.05）均對幼苗的苗高有顯著影響（圖3）。貯藏0 d 時，幼苗的苗高為2.19 cm；至360 d 時，4 種貯藏溫度下幼苗的苗高均無明顯變化，與0 d 時的苗高基本相同，不同溫度之間差異不明顯（圖3）；隨著貯藏時間的延長，不同溫度之間苗高的差異逐漸加大；至520 d 時，－70℃、－20℃和4℃條件下的苗高仍與0 d 時相似，無明顯變化，而室溫條件下的苗高顯著降低；貯藏至730 d 時，－70℃、－20℃和4℃條件下的苗高與0 d 時差異不顯著，而室溫條件下的苗高再次大幅下降。此時，室溫、4℃、－20℃和－70℃條件下的苗高分別為1.30、2.19、2.17、2.12 cm，相比于0 d 時的苗高，分別降低40.64%、0.00%、0.91% 和3.20%。

圖3 不同貯藏溫度下幼苗的苗高隨時間的變化趨勢Fig. 3 Changes of seedling height with time at different storage temperatures

2.4 貯藏溫度對幼苗根長的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F=3.06，p＜0.05）、時間（ANOVA，6df，F=5.83，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18df，F=9.41，p＜0.05）均對幼苗的根長有顯著影響（圖4）。貯藏0 d 時，幼苗的根長為3.68 cm；至360 d 時，4 種溫度下幼苗的根長變化不明顯，與0 d 時的根長差異不顯著，4 種溫度之間差異亦不顯著；隨著貯藏時間的延長，不同溫度之間根長的差異逐漸加大；貯藏至520 d 時，室溫下的根長最短，－70℃最長，4℃與－20℃介于中間，二者之間差異不顯著；至730 d 時，4 種溫度下根長的排序與520 d時一致，但不同溫度之間的差異進一步增加， 室溫、 4℃、－20℃和－70℃條件下的根長分別為0.74、3.65、3.48、 4.30 cm， 相比于0 d時的根長分別降低79.89%、0.82%、5.43% 和－16.85%。

圖4 不同貯藏溫度下幼苗根長隨時間的變化趨勢Fig. 4 Changes of root length with time at different storage temperatures

2.5 貯藏溫度對丙二醛含量的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F=56.25，p＜0.05）、時間（ANOVA，6df，F=2.70，p＜0.05）及其交互作用（ANOVA，18df，F=2.75，p＜0.05）均對種子的丙二醛含量有顯著影響（圖5）。4 種溫度條件下，種子中丙二醛的含量均隨著貯藏時間的延長逐漸升高，尤以室溫條件下的上升速度最快；貯藏至360 d 時，4 個溫度之間種子丙二醛含量差異不明顯；至520 d 時，室溫條件下丙二醛的含量明顯高于4℃、－20℃和－70℃，后三者之間差異不明顯；貯藏至730 d 時，室溫條件下丙二醛的含量進一步大幅增加，－20℃居中，略高于4℃和－70℃。此時，室溫、4℃、－20℃和－70℃條件下的丙二醛含量分別是0 d 時的3.12、2.09、2.39、2.05 倍。

圖5 不同貯藏溫度下種子丙二醛含量隨時間的變化趨勢Fig. 5 Changes of seed malonaldehyde content with time at different storage temperatures

2.6 貯藏溫度對相對電導率的影響

貯藏溫度（ANOVA，3df，F=2 255.75，p＜0.05）、時間（ANOVA，6df，F=127.12，p＜0.05）及其交互作用（ ANOVA， 18df，F=80.96，p＜0.05）均對種子的相對電導率有顯著影響（圖6）。貯藏0 d 時，種子的相對電導率最低，隨著時間的延長，相對電導率呈上升趨勢，以貯藏60～180 d上升速度最快（圖6）；貯藏至520 d 時，相對電導率與0 d 相比顯著升高（p＜0.05），且室溫的相對電導率明顯高于另外3 種溫度的；至730 d 時，室溫與另外3 種溫度之間的相對電導率差異進一步增加，此時，室溫、4℃、－20℃和－70℃條件下的相對電導率分別為95.45%、82.87%、80.75% 和79.51%，分別是0 d 時相對電導率的2.10、1.82、1.77 和1.75 倍。可見，室溫條件下相對電導率最高，4℃、－20℃、－70℃之間的差異不明顯，與丙二醛含量的結果基本一致。

圖6 不同貯藏溫度下種子相對電導率隨時間的變化趨勢Fig. 6 Changes of seed relative membrane permeabilities with time at different storage temperatures

3 討論

種子萌發是一個動態過程，受播種環境和種子活力的綜合影響[18]。在適宜的播種環境下，種子活力是決定種子發芽和出苗期間活力強度等特性的綜合表現[19]。高活力種子具有明顯的生長優勢和生產潛力，對生產具有重要的意義[20]。種子采收后進行科學貯藏是保持其活力的重要方面。貯藏溫度、濕度、基質和時間等因素均會對種子活力的保持產生重要影響[21]。

本研究中，貯藏溫度和時間均對楓香種子的發芽率和發芽勢有顯著影響。室溫、4℃、－20℃和－70℃貯藏的種子在360 d 時發芽率和發芽勢較0 d 略有降低，且不同溫度之間差異并不明顯；至520 d 時，室溫種子的發芽率和發芽勢開始明顯低于4℃、－20℃和－70℃的種子；至730 d 時，這種差異進一步增加。可見，低溫和超低溫條件下貯藏的楓香種子始終保持著較高的活力，以－70℃貯藏效果最佳，這與其它植物種子的貯藏試驗結果相似。如獨活（Heracleum hemsleyanumDiels）種子的貯藏溫度以－15℃最佳[22]；桃葉衛矛（Euonymus bungeanusMaxim）的種子在－20℃條件下貯藏可有效保持種子活力[23]。這可能是由于低溫影響了種子內部酶的活性、代謝物質的轉運和氣體交換，降低了呼吸強度，減少了胚活性物質的消耗[24]。不同植物種子適宜的貯藏溫度也存在一定的差異。張雪娟等[25]通過對4 個居群的馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi Franch.）種子的貯藏研究，發現貯藏310 d時，4℃種子的發芽勢和發芽率高于常溫和－20℃，但不同種群之間的差異顯著性有所不同。

幼苗的生長速度與質量是評價種子活力的另一個重要指標[26]。本試驗中，幼苗苗高與根長的變化趨勢與種子的發芽率和發芽勢的變化趨勢一致。貯藏360 d 時，4 種溫度之間幼苗苗高與根長的差異并不明顯；至520 d 時，室溫種子的苗高與根長開始明顯低于4℃、－20℃和－70℃種子，并隨著貯藏時間的延長，差異逐漸變大。4℃、－20℃和－70℃條件下貯藏的種子始終保持著較高的苗高與根長生長量，以－70℃貯藏效果最佳。這與杜克兵等[27]對遼寧楊（Populus liaoningensis Z.Wang et H.D.Chen cv.nov）種子（含水量10.52%）貯藏的研究結果一致，該研究認為，遼寧楊種子在進行短、中期（＜56 d）貯藏時，4℃及以下低溫即可有效保持幼苗的苗高與根長生長量，而更長期（110 d）的貯藏則以－70℃更適合。可見，當種子的含水量適宜時，低溫貯藏可以延緩種子的老化，有效保持種子的活力和幼苗生長的潛能[28]。

丙二醛含量與相對電導率常被用作種子活力的鑒定指標，指示種子劣變的程度[29-30]。丙二醛是脂質過氧化的終產物之一，可以反映細胞膜系統的受損程度[31]。當植物組織受到逆境脅迫時，往往產生細胞膜功能受損或結構破壞，導致其透性增大，細胞內的鹽類或有機物滲出，引起組織浸泡液電導率發生變化[32]。隨著種子劣變程度的加深，其丙二醛含量和相對電導率逐漸上升，細胞膜完整性逐漸喪失[33-35]。本研究中，楓香種子的丙二醛含量和相對電導率均隨貯藏時間的延長而逐漸升高，但貯藏溫度不同，變化幅度有所差異，以室溫條件下上升最快，－70℃最慢，4℃和－20℃介于中間。這一結果與水稻(Oryza sativa L.)[30]、大豆(Glycine max(Linn.) Merr.)[6]等種子的貯藏試驗結果一致。產生這一結果的原因可能與種子膜脂過氧化作用、染色體及基因的畸變以及胚蛋白的降解等有關[36]。

4 結論

當楓香種子的含水量為10.54% 時，不同溫度條件下的種子隨著貯藏時間的延長，其發芽率、發芽勢、幼苗苗高與根長逐漸降低，丙二醛含量和相對電導率逐漸升高。對于4 種貯藏溫度之間，其種子活力的相關指標（發芽率、發芽勢、幼苗苗高與根長）以及種子受損程度的相關指標（丙二醛含量、相對電導率）在360 d 時仍無明顯差異，至520 d 時差異逐漸顯現，730 d 時差異進一步增加。總體而言，貯藏360 d 時，室溫即可取得較好的貯藏效果；當時間進一步延長時，4℃、－20℃、－70℃更有利于保持種子活力，其貯藏效果明顯優于室溫，其中，以－70℃的貯藏效果最佳。