基于網絡藥理學探討清瘟解熱合劑治療新型冠狀病毒肺炎的作用機制*

朱波宇，楊 璐，王洪武，張翟軼，李 欽，崔換天，廖家抱，溫偉波△

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.云南省中醫醫院，云南 昆明 650021；3.山東大學生命科學學院/山東省動物細胞與發育生物學重點實驗室，山東 青島 266237；4.嘉興市中醫醫院，浙江 嘉興 314033）

今年初，湖北省武漢市出現了由新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。COVID-19 具有傳播迅速廣泛、傳染性強、各類人群普遍易感的特點，目前臨床尚無特效藥[1]。中醫藥作為我國的傳統醫藥，在納入新型冠狀病毒肺炎診治方案后，取得了突出的療效。COVID-19在我國傳統醫學里屬于“疫病”的范疇，多為外邪侵入機體，體內正氣不足導致。運用中醫理論進行辨證，病因為感受疫戾之氣，病位在肺，基本病機特點為“濕、熱、毒、瘀”[2-3]。

清瘟解熱合劑（Qingwen Jiere Mixture）是立足于中醫對“瘟疫”的防治理論而研制的中藥復方制劑。主要成分有：藿香、柴胡、黃芩、連翹、法半夏、草果、茵陳、馬蹄香、滑石、甘草、白薇、炒神曲、炒厚樸。藿香具有芳香化濕、和胃止嘔的功效；柴胡可以疏散退熱、升舉陽氣；黃芩和連翹能清熱、瀉火解毒；半夏可燥濕化痰、降逆止咳、消痞散結；草果能燥濕溫中、截瘧祛痰；茵陳可清利濕熱，利膽退黃；馬蹄香內服消風散氣解暑，利尿通淋去積；滑石為寒涼藥物，能清熱解暑，保護腸壁；甘草具有補脾益氣、清熱解毒和調和諸藥的功效，在驅邪的同時又扶助正氣；白薇能清熱涼、利尿通淋；厚樸歸肺經、脾經，可以燥濕行氣、消痰平喘；神曲辛溫，歸脾胃經，具有消食和胃的功效。本方配伍用藥具有清熱化濕，芳香避穢，燥濕止瀉等功效；對于治療COVID-19感染輕中癥、疑似患者及時疫感冒癥見發熱身痛，咽痛咳嗽，腹脹痞滿，大便黏膩臭穢或便溏腹瀉，納差乏力等具有顯著療效。在我國新冠肺炎疫情暴發時，清瘟解熱合劑用于云南省定點醫院及湖北省咸寧市部分受援單位，臨床療效顯著。清瘟解熱合劑用于老撾、緬甸等我國周邊國家及地區，同樣取得了良好的臨床療效。

網絡藥理學是一種常見的研究中藥復方作用機制的方法，從中醫的整體觀念出發，結合辨證論治的方法，多種學科交叉運用，構建成分-靶點-通路網絡，探求疾病和藥物的聯系[4]，為解釋中藥復雜作用機制提供了方法。本文通過網絡藥理學檢索清瘟解熱合劑的活性成分和靶點，進一步推測其治療COVID-19的作用機制，為清瘟解熱合劑臨床用于新型冠狀病毒肺炎治療，提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 清瘟解熱合劑成分篩選 檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺 TCMSP（http：//ibts.hkbu.edu.hk/lsp/tcmsp.php）[5]以“藿香，柴胡，黃芩，連翹，法半夏，草果，茵陳，馬蹄香，甘草，滑石，厚樸，白薇，神曲”作為關鍵詞進行查詢。中藥復方通常以口服為主，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）中重要的藥動學參數之一，表示口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達體循環并吸收的速度與程度，OB值越高通常表示藥物的生物活性越好[6]。類藥性（drug-like，DL）是指化合物與已知藥物的相似性，是化合物能夠成為藥物的評價指標[7]，通常以OB≥30%，DL≥0.18作為標準進行篩選得到清瘟解熱合劑的活性成分。

1.2 有效成分靶點的預測和基因名的確定 采用TCMSP數據庫對清瘟解熱合劑的作用靶點進行預測，再利用 UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）[8]規范與活性成分相關的靶點蛋白，獲得靶點對應的基因名。

1.3 疾病靶點的篩選 以“corona virus disease 2019”和“novel coronavirus pneumonia”作為關鍵詞，在 OMIM 數據庫[9]（http：//omim.org/）和 Genecards數據庫[10（]https：//www.genecards.org）中搜索疾病相關靶點。運用Venny平臺（版本2.1，http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將清瘟解熱合劑作用靶點與COVID-19靶點取交集，得到清瘟解熱合劑治療COVID-19的相關靶點。

1.4 蛋白相互作用網絡建立 將1.3得到的交集靶點導入 String 數據庫（https：//string-db.org）[11]，得到蛋白相互作用關系的網絡圖。蛋白間的連線越多，關聯度越大，成為核心靶點的概率越高。

1.5 GO分析和KEGG分析 將篩選出來的交集靶點導入 DAVID 數據庫[12]（http：//www.david.niaid.nih.gov）中進行基因功能（gene oncology，GO）富集分析，運用 KOBAS3.0 數據庫（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn）對核心靶點進行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）基因通路富集分析，以 p≤0.05、q≤0.05作為篩選指標，并對結果進行可視化處理。

1.6 藥物成分-靶點-通路網絡的建立 在Cytoscape3.7.2[13]中導入預測藥物的活性成分、核心靶點以及相關聯的通路，構建藥物成分-靶點-通路相互作用網絡，通過網絡對其相互作用機制進行闡述。

1.7 清瘟解熱合劑藥材-歸經網絡的建立 方中飲片的歸經信息從2015年版《中國藥典》中獲取，通過查取歸經信息構建清瘟解熱合劑的藥材-歸經網絡。

2 結果

2.1 清瘟解熱合劑成分篩選結果 清瘟解熱合劑活性成分篩選共得到1 357種，其中甘草280種、法半夏116種、藿香94種、茵陳53種、草果59種、連翹150種、黃芩58種、柴胡288種、馬蹄香3種、滑石1種、白薇81種、炒厚樸139種、炒神曲35種。以OB≥30%，DL≥0.18，篩選后共有264種成分符合條件，見圖 1、表 1。

表1 清瘟解熱合劑包含化學成分的對應靶標數

圖1 清瘟解熱合劑各味藥物主要有效成分數量

2.2 有效成分靶點收集結果 在TCMSP中查詢到510個有效成分靶點，將有效成分靶點名稱導入UniProt數據庫，得到靶點對應的基因名。

2.3 疾病靶點篩選結果 在OMIM數據庫和Genecards數據庫中共收集到752個COVID-19相關靶點，其中OMIM數據庫中有493個靶點，Genecards數據庫中有259個靶點。將疾病靶點和藥物成分靶點，取交集最終得到32個清瘟解熱合劑治療COVID-19的潛在靶點，見圖2。

圖2 藥物靶點-疾病靶點韋恩圖

2.4 PPI網絡構建 構建的PPI網絡中有30個作用節點，共231條相互作用連線。其中白細胞介素6（interleukin 6，IL6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、趨化因子（C-C motif ligand 2，CCL2）和絲裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）的連通度較高，是核心靶點，見圖3、表2。

表2 靶點連通度

2.5 靶點通路分析 GO功能富集分析得到GO條目共283條，其中生物過程（BP）條目226個，細胞組成（CC）條目 26個，分子功能（MF）條目 31個，分別占80%、9%、11%。我們根據P值將生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）中的各前 15名列出，見表3。

圖3 靶點相互作用網絡

表3 清瘟解熱合劑GO生物功能富集分析

KEGG通路富集分析共得到232條通路，根據p值篩選出與COVID-19有關的前10條通路，包括IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、Th17細胞分化（Th17 cell differentiation）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等通路，見表4。

2.6 成分-靶點-通路網絡構建 將篩選出來靠前的30條通路和藥物預測有效成分和疾病潛在靶點導入Cytoscape3.7.2，通過構建成分-靶點-通路網絡來闡釋其復雜的作用機制，不同節點分別代表、成分、靶點、通路。紅色三角代表-靶點，藍色四邊代表-信號通路，綠色四邊代表-活性成分，連線代表-各點之間的相互關系，見圖4。

2.7 清瘟解熱合劑藥材-歸經網絡 根據清瘟解熱合劑的歸經信息，構建藥材-歸經網絡，圖中黃色方塊表示藥材，綠色圓表示歸經。途中連接最密切的三個節點是肺 lung）、脾（spleen）和胃（stomach），連接度分別是8，8，8，說明大多數藥材的歸經是肺經、脾經和胃經。清瘟解熱合劑中13味中藥大部分中藥歸肺、脾、胃三經，說明可能對由“濕熱”導致的新型冠狀病毒肺炎具有很好的治療作用，見圖5。

表4 KEGG富集通路分析結果

圖4 清瘟解熱合劑治療新型冠狀病毒肺炎“成分-靶點-通路”網絡圖

圖5 清瘟解熱合劑藥材-歸經網絡圖

3 討論

自新型冠狀病毒肺炎爆發以來，全國疫情防控阻擊戰取得重大戰略成果，然而世界范圍內，情況依然不容樂觀。針對新型冠狀病毒肺炎，目前臨床還沒有特效藥。雖然有報道稱已經篩選了部分藥物用于臨床，但其是否有確切的治療作用尚不明確，部分藥物還處于試驗階段，不能廣泛運用于治療中。中醫藥作為我國的傳統醫藥，在疫病的防治上具有獨特的見解。2003年，中醫藥用于重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）治療的有效性和安全性得到了廣泛的認可[14]。吳鞠通的《溫病條辨》云：“溫疫者，厲氣流行，多兼穢濁，家家如是，若役使然也。”[4]新型冠狀病毒肺炎中醫范疇屬于“疫病”，致病原因多為外感疫毒邪氣，入里化熱，在臨床上以“急則治標，緩則治本，標本兼治”作為治療原則，祛邪外出的同時兼顧扶助正氣。最新發布的《新型冠狀病毒肺炎診治方案（試行第七版）》[15]指出，患者以發熱、干咳、乏力為主要表現，少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀。從中醫的角度分析，其病位在肺，兼在脾胃，病因為“濕毒疫”，因邪氣侵肺，耗傷衛氣而出現發熱、咽痛咳嗽；濕邪困脾而導致大便黏膩臭穢或便溏腹瀉。根據中醫理論分析，清瘟解熱合劑中的藥物多歸肺脾胃經，主要治療邪犯肺衛、濕邪困脾。半夏、藿香辛溫歸脾胃肺經，能化濕止嘔；茵陳清利濕熱；草果燥濕溫中，截瘧祛痰；連翹、黃芩苦寒，清熱解毒、疏散風熱、燥濕；柴胡疏散退熱，升舉陽氣；甘草補脾益氣，抵抗病邪；馬蹄香、滑石、白薇能利尿通淋；厚樸燥濕行氣、消痰平喘；神曲能消食和胃。使用此方能清熱化濕，芳香避穢，燥濕止瀉，在臨床治療患者具有良好的療效。

基于臨床治療結果，部分SARS-CoV-2感染者后期病癥加重，甚至出現死亡的情況，可能與“炎癥風暴”有關，而“炎癥風暴”的本質是細胞因子風暴（cytokine storm）。細胞因子在人體中有著重要的作用，調控細胞增殖和分化、血管發生、免疫和炎癥反應等。當患者感染病毒后，血清中的促炎因子會增加，從而導致肺部炎癥和相應的肺組織損傷。過度的免疫反應激活大量的免疫細胞，對肺泡上皮細胞和毛細血管造成彌漫性損傷，大量液體滲出到氣管中阻塞氣道，從而造成呼吸窘迫[16]。蛋白互作分析結果表明，IL6、TNF、CCL2、MAPK1等可能為清瘟解熱合劑治療COVID-19的核心靶點。此外，通過比較KEGG通路富集分析的結果，發現這些核心靶點顯著富集在IL-17信號通路、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子信號通路等通路上。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）是一種細胞中的重要信號傳導分子[17]，在炎癥反應中發揮著重要的作用，MAPK激活后可促進細胞癥因子表達[18-19]。與此同時，一些促炎性因子如TNF-α、IL6等，都可以激活MAPK通路從而加劇炎癥反應[17]。在炎癥反應中，TNF-α是一種出現最早、最重要的炎性因子，主要由單核巨噬細胞以及其它免疫細胞產生。在機體感染病毒時，TNF-α可通過激活 T細胞促進 IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等細胞因子的產生及分泌，從而介導一系列炎性反應[20]。CC趨化因子配體2（CCL2）是CC類趨化因子家族的成員，是人類發現最早的、有活性的趨化因子。當CCL2與其相應受體結合后可活化單核/巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞和Th2細胞，并向炎癥部位聚集。有研究表明由支氣管上皮細胞和巨噬細胞產生的CCL2可能會加重氣道炎癥和氣道高反應性[21]。對肺炎患者血清中的細胞因子進行分析，發現重癥患者血清中的IL-6、TNF-α等明顯高于非重癥患者，這說明這些患者癥狀的加重與這些細胞因子的升高有關。Th17細胞是新型CD4+T細胞亞群，在免疫調節方面具有至關重要的作用，Th17細胞可以分泌IL-6、TNF-α和IL-17等多種效應因子，并通過其來介導炎癥反應。IL-6可以調節Th17細胞的數目并誘導其發育[22]。因此，清瘟解熱合劑可能通過調控這些通路改善COVID-19患者的炎癥反應。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法對清瘟解熱合劑中有效成分治療新型冠狀病毒肺炎的作用進行了研究。結果顯示，清瘟解熱合劑可能是通過多成分、多靶點、多通路來協同作用的。網絡藥理學是大數據時代下的新興的學科，通過虛擬篩選技術初探了清瘟解熱合劑對COVID-19的治療作用機制，為臨床應用提供了理論依據，但由于研究方法本身具有局限性，需要在臨床中進一步試驗驗證。