云藥七龍?zhí)鞂β宰枞苑尾〈笫驨rf2和DJ-1調(diào)控作用研究*

劉 青，付 義，楊春艷，吳洪波，張愛華，張俊圖，李建梅，景海卿

（云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院/昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011）

慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害著人類的身心健康[1]。其發(fā)病原因主要是患者吸入香煙、粉塵等有害氣體或有害顆粒造成的肺部異常炎癥，表現(xiàn)為反復(fù)咳嗽、咳痰、呼吸困難、胸悶以及肺功能下降等臨床癥狀，集中發(fā)病于40歲以上的中老年人群[2]。隨著社會工業(yè)化的發(fā)展，空氣質(zhì)量不斷下降，COPD的發(fā)病率持續(xù)升高，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[3]。COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中患者肺部的氧化應(yīng)激反應(yīng)，近年來被廣泛認(rèn)為是該病的主要病因[4]，若不及時給予藥物干預(yù)，會對病人的健康造成極大的威脅[5]。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）和帕金森病蛋白（DJ-1）是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控多種抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)控因子[6]，其中DJ-1能夠通過抑制核內(nèi)Nrf2降解的速率，增加細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抵抗能力[7-9]。云南特色民族藥七龍?zhí)焓且匀摺⒓t景天為主的中藥復(fù)方，課題組前期將七龍?zhí)鞈?yīng)用于COPD患者，取得了較好療效，COPD患者的臨床癥狀得到了顯著改善[10]。本文主要研究云南特色中草藥七龍?zhí)鞂OPD大鼠的藥效，以及對Nrf2和DJ-1調(diào)控的影響，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，雄雌各半，成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2008-24。動物飼養(yǎng)于云南省中醫(yī)中藥研究院實驗動物屏障系統(tǒng)（SYXK滇2017-0003），至少飼養(yǎng)1周后使用，實驗操作符合云南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。飼養(yǎng)條件：溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。

1.2 藥物與試劑 七龍?zhí)欤ㄔ颇鲜♂t(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊批件：ZJZ2020003）的制備與質(zhì)控主要在昆明市中醫(yī)藥制劑中心（GPP認(rèn)證，滇：2010009HZ）完成，利戊巴比妥鈉和細(xì)菌脂多糖購自Sigma公司；紅河牌香煙（煙堿含量為15 mg/支），購自云南紅河卷煙廠；孟魯司特購自杭州默沙東制藥有限公司；大鼠Nrf2、DJ-1 ELISA試劑盒購自江蘇卡爾文生物有限公司。

1.3 儀器 Epoch連續(xù)波長酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；Megafugel 1.0R離心機(jī)購自德國Thermo Scientific Heraeus；玻璃熏箱自制；MP160 16通道生理儀購自Biopac公司。

1.4 COPD大鼠模型的誘導(dǎo)及分組給藥 60只SD大鼠隨機(jī)分成正常對照組、模型組、陽性藥對照組、七龍?zhí)斓汀⑵咧小⒏邉┝拷M，每組10只。除正常對照組外，每組采用氣管注入脂多糖加熏香煙方法誘導(dǎo)COPD。具體方法為：第1天和第14天，用1%的利戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 mL注射器注入溶于生理鹽水的脂多糖 200 μL（1 mg/mL），然后將大鼠固定板直立旋轉(zhuǎn)，使脂多糖能夠均勻分布于兩肺。正常組注入生理鹽水。第2～28天將大鼠放入60 cm×50 cm×40 cm熏吸箱內(nèi)，注入紅河牌過濾嘴香煙煙霧，濃度約5%，每天上午、下午各1 h。七龍?zhí)斓汀⒅小⒏邉┝拷M分別灌胃給予七龍?zhí)?.35、0.7、1.4 g/kg，陽性對照組灌胃給予孟魯司特片13 mg/kg，正常對照組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水，每日1次，持續(xù)27 d。

1.5 觀測指標(biāo)及方法

1.5.1 計算肺泡灌洗液（BALF）中有核細(xì)胞數(shù) 使用細(xì)胞計數(shù)板對肺泡灌洗液中的有核細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。

1.5.2 COPD大鼠肺功能測定 采用MP160 16通道生理儀系統(tǒng)測定各組大鼠肺功能。具體方法如下：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠徹底麻醉后用小動物剃毛機(jī)剃出頸部被毛，并碘伏消毒。打開16通道生理儀，將大鼠用膠布仰臥位固定。將呼吸換能器準(zhǔn)確連接到ECG100C放大器上，調(diào)節(jié)通道并設(shè)置通道參數(shù)。剪刀剪開頸部皮膚，并記錄實驗開始時間。左手持眼科彎鑷，右手持眼科直鑷鈍性分離皮下組織及肌肉。顯露氣管及上甲狀腺腺體后上拉鉤。于腺體后方鈍性分離氣管并帶線，注意勿損傷腺體及氣管。提起絲線，剪刀于氣管環(huán)之間剪開氣管半周。行氣管插管，接呼吸換能器。待大鼠呼吸穩(wěn)定后打開MP160軟件開始測試呼吸波，呼吸波數(shù)據(jù)采集不少于30 s。選取所采集的波形，通過MP160分析軟件自動分析出呼吸數(shù)據(jù)。

1.6 COPD大鼠肺組織及血清中Nrf2和DJ-1含量測定 末次給藥后，腹主動脈取血，血液凝固后以2 500 r/min離心10 min，取血清，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笕》谓M織，稱量肺組織50 mg，加入450 μL 1×PBS，細(xì)胞破碎儀在冰盒中充分勻漿，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)成統(tǒng)一濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附法測定Nrf2和DJ-1含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 七龍?zhí)鞂OPD大鼠有核細(xì)胞數(shù)的影響 與正常組比較，模型組肺泡灌洗液中有核細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽性藥孟魯司特和七龍?zhí)斓汀⒅小⒏邉┝拷M藥物干預(yù)后，給藥組肺泡灌洗液中有核細(xì)胞數(shù)顯著下降（P<0.05），見表1。

表1 七龍?zhí)鞂OPD大鼠有核細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 七龍?zhí)鞂OPD大鼠有核細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別劑量/（g·kg-1）有核細(xì)胞數(shù)/（104個）正常對照組 - 10.00±3.60*模型組 - 38.80±14.36陽性藥對照組 0.013 12.81±1.56*七龍?zhí)斓蛣┝拷M 0.35 19.39±8.73*七龍?zhí)熘袆┝拷M 0.7 7.35±3.42*七龍?zhí)旄邉┝拷M 1.4 4.35±1.56*

2.2 七龍?zhí)鞂OPD大鼠肺功能的影響 檢測了七龍?zhí)鞂Υ笫笞畲蠛魵饬魉伲≒EF）、潮氣量（TV）、每分鐘呼氣量（VE）的影響。與正常對照組比較，模型組大鼠PEF、TV、VE顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，陽性藥孟魯司特和七龍?zhí)熘小⒏邉┝拷M干預(yù)后COPD大鼠肺PEF、TV顯著增加（P<0.05），陽性藥孟魯司特和七龍?zhí)斓汀⒅小⒏邉┝拷M干預(yù)后肺VE明顯高于模型組（P<0.05），見表2。

表2 七龍?zhí)鞂δＰ痛笫蠓蜳EF、TV、VE的影響（±s，n=10）

表2 七龍?zhí)鞂δＰ痛笫蠓蜳EF、TV、VE的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別 劑量/（g·kg-1）正常對照組 -PEF/（mL·s-1）7.76±0.91*VE/mL 1.79±0.08*162.94±5.31*1.12±0.10 98.63±6.52 1.55±0.08*154.35±6.50*1.25±0.07 114.92±7.16*1.36±0.06*128.02±6.23*1.51±0.07*152.56±4.27*TV/mL模型組 -陽性藥對照組 0.013七龍?zhí)斓蛣┝拷M 0.35七龍?zhí)熘袆┝拷M 0.7 3.56±0.90 6.31±0.31*4.47±0.52 5.60±0.65*七龍?zhí)旄邉┝拷M 1.46.48±0.41*

2.3 七龍?zhí)鞂OPD大鼠DJ-1水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中DJ-1水平明顯降低（P<0.05），與模型組比較，七龍?zhí)斓汀⒅小⒏邉┝拷M大鼠血清中DJ-1水平逐漸升高，且七龍?zhí)熘小⒏邉┝拷MDJ-1水平明顯高于模型組（P<0.05）；而勻漿肺組織中，各組大鼠DJ-1水平無明顯變化（P＞0.05），見表 3。

表3 七龍?zhí)鞂β宰枞苑尾∧Ｐ虳J-1水平的影響（±s，n=10）

表3 七龍?zhí)鞂β宰枞苑尾∧Ｐ虳J-1水平的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別 劑量/（g·kg-1）正常對照組 -肺勻漿DJ-1/（pg·mL-1）87.51±3.24* 52.08±3.51 60.55±4.05 54.31±1.08 68.52±8.55 49.70±2.13 69.57±3.81 45.36±1.80 73.66±3.27* 46.92±2.38 84.35±1.56* 50.36±3.56血清DJ-1/（pg·mL-1）模型組 -陽性藥對照組 0.013七龍?zhí)斓蛣┝拷M 0.35七龍?zhí)熘袆┝拷M 0.7七龍?zhí)旄邉┝拷M 1.4

2.4 七龍?zhí)鞂OPD大鼠Nrf2水平的影響 與正常組比較，模型組血清Nrf2水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，七龍?zhí)熘小⒏邉┝拷M大鼠血清Nrf2水平明顯升高（P<0.05）。大鼠肺組織勻漿中，與正常組比較，模型組Nrf2水平也明顯降低（P<0.05），給予七龍?zhí)焖幬镏委熀螅髦委熃MNrf2水平逐漸升高，藥效呈現(xiàn)出了劑量依賴性，與模型組比較，七龍?zhí)熘小⒏邉┝拷M和陽性藥對照組，肺組織Nrf2水平有增加趨勢，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表 4。

表4 七龍?zhí)鞂β宰枞苑尾∧Ｐ蚇rf2水平的影響（±s，n=10）

表4 七龍?zhí)鞂β宰枞苑尾∧Ｐ蚇rf2水平的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別 劑量/（g·kg-1）正常對照組 -肺勻漿Nrf2/（pg·mL-1）1 091.62±45.2*1 085.22±64.30*970.54±53.78 956.16±37.08 976.86±29.35 1 010.60±48.29 1 039.83±53.78 972.48±37.08 1 083.77±40.4* 999.56±21.90 1 149.79±13.0*1 000.26±49.83血清Nrf2/（pg·mL-1）模型組 -陽性藥對照組 0.013七龍?zhí)斓蛣┝拷M 0.35七龍?zhí)熘袆┝拷M 0.7七龍?zhí)旄邉┝拷M 1.4

3 討論

COPD是全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的一種常見疾病，且發(fā)病率呈上升趨勢，給全世界帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)、社會負(fù)擔(dān)。香煙及其它有毒顆粒的吸入會使患者肺部產(chǎn)生炎癥，導(dǎo)致肺功能破壞的同時，還損害了機(jī)體正常的修復(fù)以及防御機(jī)制[11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，COPD大鼠造模成功后，與正常組比較，大鼠肺泡灌洗液中有核細(xì)胞數(shù)顯著增加。由于COPD患者肺功能損傷，病人會表現(xiàn)為慢性咳嗽、呼吸困難、咳痰等癥狀，且長期受到氣道損傷、氣流受限以及心血管病等多種并發(fā)癥的困擾，這些都會對患者生命健康造成威脅[12]。肺功能指標(biāo)PEF、TV、VE水平是反映COPD氣流受限及嚴(yán)重程度的重要參數(shù)[9]，實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，COPD模型組大鼠的PEF、TV、VE水平均顯著下降，給予陽性藥孟魯司特和七龍?zhí)焖幬锔深A(yù)后肺功能指標(biāo)顯著提高，說明七龍?zhí)鞂OPD大鼠有改善肺功能的作用。

研究顯示，COPD患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)較為嚴(yán)重，被認(rèn)為在發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[13]。而在機(jī)體發(fā)生慢性氧化應(yīng)激損傷時，DJ-1和Nrf2是2個關(guān)鍵因子，二者均參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程。一方面，DJ-1可以通過穩(wěn)定Nrf2的表達(dá)水平增強(qiáng)抗氧化能力[14-15]；另一方面，DJ-1的表達(dá)水平上調(diào)也能夠通過增加氧化應(yīng)激的相關(guān)酶活性參與氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)機(jī)體的抗氧化能力增強(qiáng)[16]。本研究中，脂多糖和香煙煙霧聯(lián)合在大鼠肺部造成了嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。臨床上對于COPD常規(guī)西藥治療效果不甚理想，長期使用糖皮質(zhì)激素和抗生素等藥物會造成患者免疫功能下降[17]。因此，對COPD的治療有必要進(jìn)行抗氧化和抗炎的聯(lián)合用藥。七龍?zhí)焓且匀摺⒓t景天為主的具有云南民族醫(yī)藥特色的中藥復(fù)方，三七、紅景天均具有顯著的抗炎作用。三七能明顯抑制炎癥反應(yīng)對組織的損害[18]；紅景天能夠提高機(jī)體對低氧環(huán)境的適應(yīng)性，增強(qiáng)機(jī)體對缺氧和疲勞的耐力[19]。上述藥物共用，可對患者的肺功能進(jìn)行改善。七龍?zhí)鞈?yīng)用于COPD可顯著控制臨床癥狀，改善心肺功能，提高生存質(zhì)量。在實驗中，與正常組比較，COPD造模后大鼠的DJ-1和Nrf2水平明顯降低，給予七龍?zhí)焖幬镏委熀螅髦委熃MDJ-1和Nrf2的水平逐漸升高，藥效呈現(xiàn)出了劑量依賴性，且與模型組比較，七龍?zhí)熘小⒏邉┝拷M的變化顯著。但這種上升趨勢僅表現(xiàn)在大鼠血清中，在肺組織勻漿中變化不明顯。這些結(jié)果表明，七龍?zhí)鞂OPD的影響可能是通過調(diào)節(jié)血清中DJ-1和Nrf2的水平，改善機(jī)體氧化應(yīng)激能力實現(xiàn)的。

綜上所述，結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，COPD肺功能損傷嚴(yán)重，且氧化應(yīng)激在COPD發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用[20]。DJ-1和Nrf2可調(diào)控氧化應(yīng)激的關(guān)鍵步驟，并在COPD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。七龍?zhí)鞂OPD大鼠具有一定的治療作用，可以提高大鼠的抗氧化相關(guān)因子水平，但仍需要更多研究確認(rèn)七龍?zhí)鞂Ψ喂δ艿谋Ｗo(hù)作用。本研究緊跟現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對COPD發(fā)病機(jī)制的研究前沿，對于開發(fā)云南特色民族藥七龍?zhí)鞂β院粑老嚓P(guān)疾病的防治具有重要的理論及實踐意義。