大柴胡湯及其拆方對非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型“肝-腸軸”影響的形態學

高譽珊 張鑫蕾 吳夢瑤 周璐 張淑靜 陳琳 王敏 孫燕 鄭豐杰 李宇航

摘要?目的：觀察大柴胡湯及其拆方（方劑要素）對非酒精性脂肪肝病（NAFLD）大鼠模型“肝-腸軸”肝、腸形態學的影響。方法：采用隨機數字表法將大鼠隨機分為正常組、模型組、鹽酸吡格列酮組、大柴胡湯組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄濁組。采用高脂高糖飼料喂養16周建立NAFLD模型，并于第13～16周分別給予大柴胡湯及拆方。造模結束后，取小腸組織，電鏡觀察細胞間緊密連接情況，采用HE染色、油紅O染色、Masson染色觀察各組大鼠肝組織。結果：模型組腸細胞間隙明顯增大，緊密連接程度降低，各給藥組細胞間隙均有不同程度地減小，以全方組最為顯著;正常組大鼠肝細胞結構正常，模型組大鼠部分肝細胞呈氣球樣變性，見不同程度脂滴形成，各給藥組較模型組脂滴情況均有不同程度減輕。結論：大柴胡湯及其拆方均能不同程度地改善NAFLD模型大鼠肝細胞脂肪變及腸細胞緊密連接情況，并以全方共用效果尤著，疏肝利膽、健脾化痰、通腑泄濁等治法聯合運用對改善NAFLD具有較好的療效。

關鍵詞?大柴胡湯;方劑要素;拆方研究;非酒精性脂肪性肝病;肝-腸軸;形態學;電鏡;油紅O染色

Abstract?Objective：To observe the effect of Dachaihu Decoction（DD）and its decomposition（formula-factors）on liver and intestine morphology of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）model rats.Methods：Rats were divided into a normal group，a model group，a pioglitazone hydrochloride group，a DD group，a Shugan Lidan group，a Jianpi huatan group and a Tongfu Xiezhuo group by random number table.NAFLD model was established by feeding high-fat and high-sugar diet for 16 weeks，and DD and decomposition were given at 13-16 weeks respectively.After modeling，small intestinal tissues were taken and tight junctions between cells were observed by electron microscopy.Liver tissues of rats in each group were observed by HE，oil red O and Masson staining.Results：The intestinal intercellular space of the model group increased significantly and the degree of tight junction decreased，the intercellular space of each drug group decreased，especially in the DD group.The structure of hepatocytes in the normal group was normal，some hepatocytes in the model group showed balloon-like degeneration，and lipid droplets were formed in varying degrees.The lipid droplets in each drug group were alleviated to compare with the model group.Conclusion：DD and its decomposition can improve the fatty degeneration of hepatocytes and the tight junctions of intestinal cells in NAFLD model rats to varying degrees，and the effect of all prescriptions is particularly effective.The combined use of treatments such as soothing the liver and promoting gallbladder，invigorating the spleen and removing phlegm，and clearing the fu organs can improve NAFLD with good effect.

Keywords?Dachaihu Decoction; Formula-factors; Research on decomposition; Non-alcoholic fatty liver disease; Liver-intestinal axis; Morphology; Electron microscope; Oil red O staining

中圖分類號：R289.4文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.012

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確損肝因素所導致的以肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，是與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟損傷。目前臨床主要推薦使用吡格列酮等胰島素增敏劑進行治療[1]。近年來隨著“肝-腸軸”概念的提出，肝病的發生與腸黏膜屏障的關系逐漸受到關注。研究表明，腸黏膜屏障功能受損，致使腸黏膜通透性改變，會導致腸道內細菌及其產物（如內毒素等）移位至腸外的肝組織，引起其免疫系統異常活化和炎性反應，從而誘導NAFLD的發生發展[2-3]。

中醫學根據NAFLD“脾失健運、肝失疏泄、痰濁內生、濕熱內蘊、瘀血阻滯”的主要病機，采用調理肝脾、祛痰化瘀、利濕泄濁等治法進行治療，取得較好療效[4-10]。然而，針對NAFLD所使用的中醫復方中，藥物之間的作用較為復雜，方劑要素的作用靶點及不同方劑要素間發生協同作用的機制仍未明確。為此，本實驗選取大柴胡湯及其拆方（方劑要素）為主要干預手段，以NAFLD大鼠模型為干預對象，主要從腸、肝的形態學角度對具有疏肝利膽、健脾化痰、通腑泄濁之效的大柴胡湯及其拆方作用效果進行探討，以期為中醫臨床治療NAFLD時更為明確地選擇相應治法提供基礎實驗依據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物

SPF級SD雄性大鼠105只，體質量（180±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。大鼠于SPF級動物房內飼養，室溫為22 ℃，濕度為50%。適應性喂養7 d以后開始造模，整過程自由進食、飲水。

1.1.2?藥物

中藥材購自北京同仁堂醫藥藥材有限公司，經北京中醫藥大學中藥鑒定研究室鑒定;鹽酸吡格列酮片購于京東大藥房（中美華東制藥，產品批號：170102）。

1.1.3?試劑與儀器?蘇木素（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1140-500）;伊紅（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1100-500）;無水乙醇（北京化工廠，貨號：BH100535）;0.9%生理鹽水（雙鶴藥業，貨號：PB30164）;二甲苯（北京化工廠，貨號：1929462024）;中性樹膠（北化試劑，貨號：N861409）;飽和油紅O染液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1260-100）。移液器[Eppendorf艾本德（中國），型號：Reference];電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：AL204];生物組織包埋機（金華市益迪醫療設備有限公司，型號：YD-6L）;電熱恒溫培養箱（天津市中環實驗電爐有限公司，型號：DH-1000）;電熱鼓風干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司，型號：PH-101A）;珊頓全自動切片機[Thermo賽默飛（中國），型號：HM-325];照相顯微鏡[Olympus奧林巴斯（中國），型號：BX53]。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

根據以往研究提出的“方-證要素對應”組方規律[11]，將大柴胡湯按照所對應的“證候要素”，拆方分成以下3個“方劑要素”，即與“肝膽疏泄失職”證候要素相對應的疏肝利膽藥組，其方劑要素為柴胡、黃芩、芍藥;與“脾虛痰濕中阻”證候要素相對應的健脾化痰藥組，其方劑要素為半夏、生姜、大棗;與“大腸濁熱”證候要素相對應的通腑泄濁藥組，其方劑要素為大黃、枳實。

按隨機數字表法隨機分為正常組、模型組、鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄濁組、大柴胡湯組7組，每組15只，于SPF級動物房內飼養。

根據文獻[9]及預實驗驗證，選定高脂高糖飼料配方為：52.5%維持飼料+30%蔗糖+10%豬油+2%膽固醇+5%蛋黃粉+0.5%膽酸鈉。適應性喂養7 d后，正常組予以維持飼料喂養，其余組均予以高脂高糖飼料自由采食16周，以期建立NAFLD模型。造模結果判定：采用美國國立衛生研究院NASH臨床研究網絡病理工作委員會2005年制定的指南（表1），進行NAFLD活動度積分（NAFLD Activity Score，NAS）評分，其中NAS>5分者明確診斷為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），NAS<3分可排除NASH。

1.2.2?干預方法

鹽酸吡格列酮片參照文獻[10]予以10 mg/（kg·d）制成懸濁劑。大柴胡湯（柴胡15 g、黃芩9 g、白芍9 g、法半夏9 g、生姜15 g、大棗12 g、生大黃6 g、燙枳實9 g）劑量參照《方劑學》教材[12]，并按照體表面積法換算求得大鼠單位體質量生藥量8.64 g/kg[13]：疏肝利膽組（柴胡15 g、黃芩9 g、白芍9 g）3.39 g/kg;健脾化痰組（法半夏9 g、生姜15 g、大棗12 g）3.70 g/kg;通腑泄濁組（生大黃6 g、燙枳實9 g）1.54 g/kg。第13～16周，分別給予各實驗組大鼠相應藥液灌胃，3 mL/只，1次/d，正常組、模型組同時予以等量蒸餾水。

1.2.3?檢測指標與方法

第16周末次灌胃后，禁食12 h后取材，稱量肝臟濕重。取肝組織及腸組織進行冰凍切片、石蠟切片及超薄切片。使用石蠟切片進行HE染色及Masson染色，冰凍切片進行油紅O染色，超薄切片觀察腸組織細胞間隙情況。其中，肝臟脂滴空泡狀面積率的計算使用圖像處理軟件Image pro plus 6.0（Media Cybernetics，美國）對各組油紅O染色的肝臟脂滴空泡狀面積率進行計算，公式為：肝臟脂滴空泡狀面積率=100×脂滴空泡狀面積/圖片總面積，噪聲點的過濾閾值為200，以3×3的像素進行面積計算，H：0～20[14]。

1.3?統計學方法

采用IBM SPSS 20.0統計軟件對各組間的差異進行統計學分析，各組腸組織細胞間隙的寬度與肝臟脂滴空泡狀面積率數據等計量資料以均值±標準差（±s）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?大體觀察

正常組大鼠肝臟外觀形態正常，呈紅褐色，表面光滑有光澤，邊緣銳利、質地韌;模型組大鼠肝臟體積明顯增大，呈黃褐色，表面粗糙，包膜緊張，邊緣變鈍，質地較軟，切面有油膩感;鹽酸吡格列酮組大鼠肝臟呈紅黃相間，邊緣較銳利，質地偏軟;疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄濁組及大柴胡湯組大鼠肝臟呈淺黃色，表面較模型組細膩，稍有包膜緊張，邊緣稍鈍，質地偏軟。

2.2?光鏡觀察

2.2.1?肝組織HE染色

如圖1所示，正常組大鼠肝小葉結構完整、清晰，匯管區界線清楚，肝細胞結構正常，肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀分布，肝竇清晰可見;模型組大鼠肝細胞腫脹，部分細胞呈氣球樣變，細胞核被擠向一邊，多數肝細胞內可見大小不等、數量不一的脂滴空泡，肝索排列紊亂;鹽酸吡格列酮組大鼠呈輕度脂肪變，部分細胞內可見細小脂滴空泡，肝索排列較亂;疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄濁組大鼠肝組織均可見不同程度彌漫性肝細胞脂肪變，但脂肪變程度較模型組呈不同程度減少;大柴胡湯組大鼠肝細胞彌漫性脂肪變較模型組顯著改善，部分細胞結構正常，遠離中央靜脈細胞可見小泡型脂滴空泡，肝索排列紊亂。

2.2.2?肝組織油紅O染色

如圖2所示，正常組大鼠肝組織中無染色脂滴;模型組大鼠肝細胞內脂滴呈彌漫性、顆粒狀堆積，融合成片狀;鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄濁組、大柴胡湯組大鼠肝細胞脂滴數量均較明顯減少，較為稀疏，脂滴體積相對較小，呈小顆粒狀不均勻分布。表2為肝臟脂滴空泡狀面積率統計結果。結果顯示全方組效果呈優于其余拆方組的趨勢。

2.2.3?肝組織Masson染色

如圖3所示，各組大鼠肝組織均未出現增多膠原纖維分布，即未形成肝纖維化。

2.2.4?電鏡觀察

腸細胞緊密連接情況如圖4所示，模型組較正常組腸細胞間隙擴大，給藥組腸細胞間隙見不同程度減小。每組隨機取15處腸間隙，測量該間隙最大值。見表3。可見模型組與其余各組比較，腸細胞間隙明顯增大，差異有統計學意義（P<0.05）;大柴胡湯組與除疏肝利膽組外各組比較，腸細胞間隙減小顯著，差異有統計學意義（P<0.05）。

3?討論

3.1?造模情況分析

NAFLD動物模型大致可分為3類：營養型脂肪肝模型、藥物中毒型脂肪肝模型和特殊種系動物的先天性遺傳性脂肪肝模型[15]。本實驗模擬臨床NAFLD常見病因，采用東方人群尤其是中國人多見的高脂高糖飲食喂養SD雄性大鼠建立營養型NAFLD大鼠模型。根據NAFLD活動度積分（NAS）評分，本實驗模型組病理評分NAS=4分，說明本實驗通過高脂高糖飼料喂養建立的大鼠模型已明確達到非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic Fatty Liver，NAFL）階段，為向非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）進展階段，證明NAFLD模型建立成功。

3.2?大柴胡湯及其拆方對NAFLD療效分析

腸黏膜屏障主要由機械屏障、化學屏障、免疫屏障、生物屏障等組成[16-17]。其中，機械屏障由腸道黏膜上皮細胞、上皮細胞間緊密連接和黏液凝膠層等構成[18]。最直接、最準確評價腸黏膜屏障功能的量化指標是腸黏膜通透性，腸黏膜通透性取決于腸黏膜上皮細胞是否受到損傷以及細胞間緊密連接是否完整。研究表明，肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）是細胞收縮的關鍵酶，可使肌球蛋白輕鏈磷酸化（MLC），促使肌動蛋白收縮，破壞細胞間的緊密連接蛋白，使細胞骨架收縮，進而使腸上皮通透性增加，腸黏膜機械屏障遭到破壞，致使NAFLD的病情進一步發展[19]。多項研究發現，藥物及其有效成分可提高緊密連接蛋白的表達[20-24]，從而減小腸細胞間隙，降低腸黏膜通透性，保護腸黏膜屏障。

中醫學依據NAFLD患者臨床所見乏力、消化不良、肝區隱痛、肝脾大以及肥胖、空腹血糖增高、血脂代謝紊亂、高血壓等代謝綜合征相關表現，認為其病機主要為肝脾不和、痰瘀互阻、濕熱內蘊。大柴胡湯為《傷寒雜病論》經典名方，全方由“柴胡半斤，黃芩三兩，半夏半升，枳實四枚，芍藥三兩，大黃二兩，生姜五兩，大棗十二枚”組成，見于《傷寒論》103條：“嘔不止，心下急，郁郁微煩者，為未解也，與大柴胡湯下之則愈”;136條：“傷寒十余日，熱結在里，復往來寒熱者，與大柴胡湯”;165條：“傷寒發熱，汗出不解，心中痞硬，嘔吐而下利者，大柴胡湯主之”及《金匱要略·腹滿寒疝宿食病脈證并治》第12條：“按之心下滿痛者，此為實也，當下之，宜大柴胡湯”。其主治癥狀與NAFLD的臨床表現頗為相似。對其組方進行分析：“柴胡配黃芩除少陽之邪;大黃配枳實以泄陽明熱結;芍藥清膽，緩急止痛，與大黃相配，可治腹中實痛，與枳實相伍，可以理氣和血;半夏與生姜配，治嘔逆不止。大棗與生姜配，能和營衛而行津液，并調和諸藥”[25]，可見全方以柴胡、黃芩、白芍調肝，半夏、生姜、大棗理脾，大黃、枳實通腑泄濁、行氣活血、清熱化濕，故可針對NAFLD核心病機起到良好的治療作用。

本實驗中，正常組大鼠腸細胞間可見細胞連接復合體，且緊密連接結構較長;造模后細胞連接結構局部出現異常，有些橋粒張力微絲稀疏，某些連接處出現空泡，可見造模導致腸黏膜屏障受損;各給藥組大鼠腸細胞間隙減小，說明各藥物均能在一定程度上減小腸黏膜間隙，且以大柴胡湯全方明顯優于其拆方;肝細胞染色及相關數據亦清晰表明，用藥后肝內脂滴數量有所減少，且全方組優于各拆方組。分析其原因如下：NAFLD一病，以患者平素飲食無度為主要病因，肥甘厚膩之品助濕生痰，困阻脾胃，土壅木郁，則肝膽疏泄不利，氣機郁滯，血行不暢，久郁化熱，形成濕熱內蘊、痰瘀互結之證。大柴胡湯一方，以柴胡、黃芩為君藥，疏利肝膽，清少陽之邪，以大黃、枳實為臣藥，通腑泄濁，泄陽明熱結;芍藥柔肝緩急止痛，理氣和血;半夏、生姜相配，消痞散結，和胃止嘔;大棗、生姜相伍，健脾和胃，調和諸藥。全方以疏肝利膽為核心，故單用健脾化痰之半夏、生姜、大棗或通腑泄濁之大黃、枳實，效果不如疏肝利膽之柴胡、黃芩、白芍;同時，全方合用，君藥之疏肝利膽配以臣藥之通腑泄濁及佐使之健脾化痰，效果更佳。可見，針對NAFLD一病，大柴胡湯方藥的君臣佐使之配伍亦不可忽視。

綜上所述，大柴胡湯及其拆方能減輕NAFLD模型大鼠腸黏膜屏障損傷，降低腸黏膜通透性，保護小腸黏膜及其屏障功能，同時亦能減輕NAFLD模型大鼠肝細胞脂肪變程度。大柴胡湯全方在調節肝臟脂質代謝、保護腸道黏膜屏障方面作用優于單純“疏肝利膽”“健脾化痰”“通腑泄濁”等要素，說明3個方劑要素配伍具有協同作用，全方總效應大于各要素單獨之效應。大柴胡湯對NAFLD模型大鼠“肝-腸軸”形態學的影響，體現出其“肝腸同治”配伍組方的合理性和有效性。

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（2019-07-03收稿?責任編輯：楊覺雄）