同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯質譜法快速同時測定膠原蛋白食品中16種激素

黃碧慧

摘 要：本文建立了一種基于超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）同時測定膠原蛋白產品中激素的方法。樣品用乙酸乙酯提取，用20%甲醇水進行轉換溶劑后，用Plexa柱固相萃取柱凈化，甲醇洗脫。以甲醇-水為流動相，樣品經Kinetex C18柱（150 mm×3 mm，2.6 μm）梯度洗脫分離，在多反應監測模式下進行定性與定量分析。其中孕激素采用正離子掃描方式，雌激素采用負離子掃描方式，內標法定量，方法檢出限為0.4～2.0 μg·kg-1。16種激素在高、中、低3個添加水平下的平均回收率分別為75%～115%，85%～105%，85%～118%，相對標準偏差分別為3.8%～13.4%、2.3%～10.4%和5.2%～14.0%。該方法操作簡單、靈敏度高，適用于膠原蛋白產品中16種激素的檢測。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜;固相萃取;激素;膠原蛋白

Abstract：An UPLC-MS/MS based method for simultaneous determination of estrogen and progesterone in collagen products was developed. Sample was extracted by ethyl acetate， followed by solvent exchange and purification using Plexa SPE column. Further separation of the 16 target compounds was achieved on a Kinetex C18 column （150 mm×3 mm，?2.6 μm） via UPLC by gradient elution with using methanol/water as mobile phase. The analytes were determined qualitatively and quantitatively under the multi-reaction monitoring scan type with tandem mass analyzer， including a positive polarity mode for the progesterone， and a negative polarity mode for the estrogen， respectively. The analysis was performed using internal standards with detection limit of 0.4～ 2.0 μg·kg-1. The recovery of 16 hormones at low， median and high level is 75%～115%， 85%～105% and 85%～118% with relative standard deviation of 3.8%～13.4%， 2.3%～10.4% and 5.2%～14.0%， respectively. The method is simple and sensitive， and can be used for the detection of 16 hormones in collagen products.

Key words：UPLC-MS/MS; SPE; Hormones; Collagen foods

中圖分類號：O657.63

膠原蛋白在細胞再生，保證皮膚、骨骼發揮正常功能中有著重要的作用[1-2]。近年來，膠原蛋白類產品在市場上備受追捧，消費者購買需求旺盛，但膠原蛋白的一些負面報道也隨之而來，由于一些激素有防止皮膚老化、除皺、增加皮膚彈性等作用[3-4]，產品中非法添加激素的負面消息卻不絕于耳。若長期食用這些激素，可對人體產生內分泌干擾作用，并影響身體健康。目前，市面上大部分膠原蛋白產品屬于食品中的飲料類、糖果類等，這類食品的監管很少涉及激素項目的檢測，并且也暫無關于這類食品中多激素檢測的相關方法標準，因此建立一種膠原蛋白產品中多激素的檢測方法顯得十分必要。

膠原蛋白產品中含豐富的蛋白、糖等基質，在檢測過程中必然存在基質效應（ME）的問題，增加了多激素凈化和檢測的難度。目前，多激素檢測普遍采用的方法有氣質聯用法[5-7]、液相色譜法[8-10]和液質聯用法[11-15]，其中液質聯用法因其高穩定、特異性強、前處理簡單不需要衍生等特點，近年來被廣泛應用于各種化合物的檢測中。本研究建立了同位素內標-高效液相色譜-串聯質譜儀膠原蛋白產品中7種雌激素（雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚）、9種孕激素（炔諾酮、21α-羥基孕酮、17α-羥基孕酮、甲基炔諾酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、孕酮和甲羥孕酮乙酸酯）的測定分析方法，實現對各類激素的快速準確測定。

1 材料與方法

1.1 儀器設備、試劑與耗材

API 5500Q Trap型三重四級桿質譜儀（美國AB公司）;1290超高壓液相色譜分離系統（美國安捷倫公司）;20通道固相萃取裝置（美國安捷倫公司）;MS2旋渦混勻器（德國IKA有限公司）;CF15RN高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）;MV5氮吹濃縮儀（美國LabTech公司）。

標準品購自德國Dr. Ehrenstorfe，包括雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、己二烯雌酚、炔諾酮、21α-羥基孕酮、17α-羥基孕酮、甲基炔諾酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、孕酮和甲羥孕酮乙酸酯（純度>97%）共16種激素。以甲醇為溶劑配制成質量濃度為100 mg·L-1的單標儲備液，于-20 ℃儲存。臨用時根據需要配制所需的濃度。

11種激素內標，分別為炔諾孕酮-D6、孕酮-D9、甲地孕酮乙酸酯-D3、甲羥孕酮-D3、美侖孕酮-D2、炔諾酮-13C2、雌酮-D2、雌二醇-13C2、己烯雌酚-D8、己二烯雌酚-D2和己烷雌酚-D4（純度>97%）。以甲醇為溶劑配制成質量濃度為10 mg·L-1的單標儲備液，于-20 ℃儲存。

乙酸乙酯、甲醇，均為色譜純，購自美國默克公司;實驗用水為自制Mill-Q超純水。

固相萃取柱：Bond Elut Plexa柱（3 mL/60 mg，Agilent公司）。液相色譜柱Kinetex C18（150 mm×3 mm， 2.6 μm，美國Phenomenex公司）。

實驗用的膠原蛋白類食品于網絡上采購收集，包括膠原蛋白糖果、膠原蛋白固體飲料和膠原蛋白飲品3種類型產品。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品的制備

取多個預包裝的樣品直接混合均勻，膠原蛋白糖果樣品充分粉碎并攪拌均勻。取其中的200 g裝入玻璃容器中，密封，試樣于4 ℃保存。

1.2.2 樣品的提取

稱取（2±0.01）g制備后的樣品于50 mL聚乙烯離心管中，其中糖果與固體飲料需加入少量水（視情況而定）至樣品溶解，而液體飲品不需要加水，然后加入5 mL乙酸乙酯溶液，2 000 r·min-1渦旋混合1 min，在4 ℃，12 000 r·min-1離心3 min，重復提取2次，合并上清液。

1.2.3 樣品的凈化

將上清液氮吹至近干后，加入2 mL，20%甲醇水（v∶v）復溶，渦旋混勻，待凈化過柱。加入依次以6 mL甲醇和6 mL水活化的Plexa小柱，以1滴/s的速度過柱，棄去流出液，再用6 mL 25%的甲醇水（v∶v）進行淋洗，抽干，最后用8 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液在40℃氮吹濃縮至近干，用1.0 mL，20%甲醇水（v∶v）溶液復溶，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，上機待測。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

柱溫：35 ℃，流速0.3 mL·min-1，進樣量：2.0 μL。流動相：10%甲醇水（v：v）（A1）和甲醇（B1）;梯度洗脫程序：0～1 min，40% B1;1～6 min，40%～60% B1;6～9 min，60%～90% B1;9～10 min，90% B1;10.1～15 min，40% B1。

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離源;掃描方式：正負離子同時監測;氣簾氣壓（CUR）：25 MPa;電噴霧電壓（IS）：5 500 V;離子化溫度（TEM）：550 ℃;霧化氣壓力（GS1）：50 MPa;干燥氣壓力（GS2）：50 MPa。目標物的質譜參數定性、定量離子對，去簇電壓（DP）及碰撞電壓（CE）見表1。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

實驗中的化合物屬于非極性物質，根據相似相溶的原理，提取溶劑也應選用非極性溶劑，乙酸乙酯作為非極性物質提取溶劑有著不可取代的優勢，尤其在處理含有大量水分的液體樣品，與乙腈、甲醇等與水能互溶的提取溶劑相比，前處理還能減少繁瑣的除去樣品中水分的步驟，實現快速提取測定的目的，因此本文選擇乙酸乙酯作為實驗的提取溶劑。另外，由于固體樣品不溶于乙酸乙酯，為了使樣品提取更完全，在處理固體樣品時，先加少部分水，將樣品溶解后，再加適量的乙酸乙酯提取。

2.1.2 凈化方法的優化

16種化合物結構中沒有銨鹽、羧酸官能團，因此不適宜選擇用離子交換柱作為凈化樣品的固相萃取柱。Plexa柱是一種非極性二乙烯基苯基的中性聚合物吸附劑，可以利用其非極性保留機理凈化樣品。同時為了在上樣過程中能更好地在柱上有保留，在用乙酸乙酯提取完成后，要先進行溶劑轉換。復溶溶劑為一定濃度的甲醇水溶液，復溶溶劑中甲醇的含量不能過高，過高會導致上樣時目標化合物在固相萃取柱的不保留，過低不利于非極性目標物的溶解。本實驗考察了不同體積分數比的甲醇水溶液作為上樣溶劑時的處理效果。不同復溶溶劑濃度下高回收率的化合物數目如圖1所示，結果表明甲醇體積比在20%時，所有目標化合物的回收率能達到90%以上。

2.2 色譜條件的優化

本研究采用了Phenomenex的Kinetex C18液相色譜柱，能有效分離16種激素化合物。質譜采集采用了正負離子同時監測的MRM模式，因此在選擇流動相體系時，應同時兼顧正負離子模式下的離子化效率，讓各化合物都能達到良好的響應。本研究考察了在乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨、甲醇-水3種流動相體系下目標化合物的靈敏度和重現性，結果表明：正離子采集模式下的孕激素在乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-水流動相體系下的響應值接近，都比在乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨體系下的響應值高。但孕激素在乙腈-0.1%甲酸水體系下的噪音強，基線高;在另外兩個體系下的基線低，性噪比高。負離子采集模式下的雌激素在乙腈-0.1%甲酸水體系下雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮無響應，其余化合物響應也不高;在乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨體系下響應次之;在甲醇-水體系中的響應最高，峰形好、性噪比最高。綜合上述實驗結果，最終選擇甲醇-水為分析流動相。16種激素定量離子MRM色譜圖見圖2。

2.3 質譜條件的優化

本研究采用大氣壓電噴霧離子源，正負離子同時監測模式對16種激素進行測定，采用蠕動泵進樣方式，將16種激素標準溶液（其中炔雌醇、雌二醇、雌三醇濃度為200 ng·mL-1，其余各激素為100 ng·mL-1）分別注入質譜中。先進行一級質譜分析，得到各自的母離子。再對目標化合物進行二級質譜掃描，得到物質的子離子信息，最后通過優化各物質的去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），確定各目標化合物的質譜參數，質譜參數見表1。

2.4 方法學評價

2.4.1 基質效應

基質效應在質譜法中普遍存在，影響實驗的準確度和精密度。因此在高效液相色譜-質譜分析方法開發和驗證過程中需要對基質效應進行評價[16]。本文分別采用甲醇和膠原蛋白飲品空白基質液配制激素的混標溶液，其中炔雌醇、雌二醇、雌三醇濃度為20 ng·mL-1，其余激素濃度為10 ng·mL-1。分別上機測定，比較在沒有基質和有基質的條件下，各激素的響應值變化。基質效應的計算方法見公式（1）。

由測定結果可知，正離子模式采集下的孕激素基質效應不是很明顯，只有炔諾酮和甲基炔諾酮有略微的抑制效應，抑制率在60%～70%。但負離子模式下采集的雌激素全都有基質增強效應，增強率在110%～150%。基質效應的存在，影響了目標物的測定結果。由于內標物與目標化合物有相同的化學性質，在質譜檢測過程中能有相似的響應行為，因此采用內標法定量最能有效的消除基質效應。

2.4.2 內標物的選擇

實驗本著盡量選擇與目標物相對應的同位素化合物作為內標物的原則，對16種性激素進行定量。但仍有部分化合物（如21α-羥基孕酮、17α-羥基孕酮、乙酸氯地孕酮、甲羥孕酮乙酸酯、炔雌醇、雌三醇）無相應的同位素化合物。因此，為了達到準確定量的目的，通過分析標準品與內標物的響應數據，選擇出峰時間接近、并與目標化合物有相應響應行為的同位素化合物作為其定量采用的內標物。化合物對應的內標物見表1。

2.4.3 線性范圍、檢出限

本研究采用內標法對目標化合物進行定量分析。配制系列梯度水平的目標物溶液，內含相同濃度的內標液（除雌二醇-13C2濃度為10.0 ng·mL-1外，其余內標濃度為5.0 ng·mL-1）作為標準溶液。以定量離子峰面積為縱坐標，以各化合物濃度與相應的內標物濃度的比值為橫坐標進行線性回歸，以最低濃度響應的3 倍信噪比（S/N≥3）對應的濃度作為檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N≥10）對應的濃度作為定量限（LOQ）。結果見表2。從表2可以看出，16種化合物在一定的范圍內線性關系良好，其相關系數達到了0.99以上。

2.4.4 回收率和精密度

按照2.2節的前處理方法分別選取膠原蛋白飲品、膠原蛋白固體飲料、膠原蛋白糖果空白樣品為測試對象，考察了3類樣品高、中、低（2 μg·kg-1、10 μg·kg-1、20 μg·kg-1）3個水平的加標實驗，每個添加水平平行測定6次。求出各化合物的平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。測定結果顯示：在膠原蛋白飲品、膠原蛋白固體飲料、膠原蛋白糖果樣品中，16種激素在2 μg·kg-1加標水平時，相對標準偏差為3.8%～13.4%，平均回收率為75%～115%;在10 μg·kg-1加標水平時，相對標準偏差為2.3%～10.4%，平均回收率為85%～105%;在20 μg·kg-1加標水平時，相對標準偏差為5.2%～14.0%，平均回收率為85%～118%。方法準確度和精密度均滿足檢測的要求。

2.5 實際樣品檢測

運用本研究建立的方法對市售膠原蛋白飲品、膠原蛋白固體飲料、膠原蛋白糖果10份樣品進行16種激素的檢測，檢測結果顯示未見有目標激素檢出。

3 結論

本研究建立了同位素稀釋-固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定膠原蛋白食品中16種激素的檢測分析方法，該方法具有簡單快捷、靈敏度高、準確度和精密度高等優點。使用乙酸乙酯作為提取溶劑，固相萃取法凈化，同時利用同位素內標消除樣品基質效應，使樣品前處理方法適合不同類型的膠原蛋白產品。選擇合適的正負離子同時采集的流動相體系，實現一次上機完成16種激素同時測定的目的。

參考文獻：

[1]周雪松.膠原蛋白肽產業現狀及發展趨勢[J].食品與發酵工業，2013，39（6）：111-115.

[2]Farndale R W. Collagen-binding proteins：insights from the Collagen Toolkits[J]. Essays In Biochemistry，2019，63（3）：337-348.

[3]王麗，張伶俐.激素補充治療的安全性研究進展[J].實用婦產科雜志，2016，32（4）：262-265.

[4]袁麗君，徐莊劍，許祥生.牛奶中的雌激素及其安全性[J].國際內科學雜志，2007，34（4）：712-714.

[5]孫漢文，李揮，康占省，等.氣相色譜-質譜法同時檢測嬰幼兒配方奶粉中的6種雌激素殘留[J].河北大學學報（自然科學版），2011，6（3）：607-611.

[6]馬麗莎，戴曉欣，謝文平，等.QuEChERS/GC-MS法同時測定魚、蝦中的雌二醇與己烯雌酚殘留[J].分析測試學報，2015，34（1）：62-66，72.

[7]Sena K，Dotse S C，Merve F，et al. Determination of endocrine disruptive phenolic compounds by gas chromatography mass spectrometry after multivariate optimization of switchable liquid-liquid microextraction and assessment of green profile[J].Chemosphere，2019，235：205-210.

[8]王全一，矯筱蔓，董宇，等.高效液相色譜法檢測中成藥中4種雌激素的方法研究[J].藥物分析雜志，2011，31（2）：344-347.

[9]程俊.高效液相色譜-二極管陣列/熒光檢測器串聯法同時測定化妝品中8種性激素的研究[J].分析試驗室，2016，35（1）：112-116.

[10]周江，黃艷美，龔越飛，等.超高效液相色譜法測定美白、祛痘化妝品中4種禁用激素[J].化學分析計量，2016，25（2）：52-55.

[11]Mengting W，Yang W，Bin P，et al. Multi-class determination of steroid hormones and antibiotics in fatty hotpot ingredients by pressurized liquid extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2019，171：193-203.

[12]楊金泉，賀小敏，施敏芳，等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定地表水中9種性激素[J].中國環境監測，2019（3）：19-27.

[13]Aga D S，He P. Comparison of GC-MS/MS and LC-MS/MS for the analysis of hormones and pesticides in surface waters： Advantages and pitfalls[J].Analytical Methods，2019，11（11）：1436-1448.

[14]馮月超，賈麗，王建鳳，等.超高效液相色譜-質譜聯用法檢測魚肉中23種性激素殘留量[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（16）：4417-4426.

[15]馬微，程麗，張蘭威，等.基質分散固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定減肥保健食品中20種違禁添加藥物[J].分析化學，2014，42（8）：1161-1170.

[16]Liu Z C，Yang F，Yu K J，etal. Multi-residue determination of five antiviral drugs in chicken tissues by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Chinese Journal of Chromatography，2012，30（12）：1253-1259.