氨基酸分析儀測(cè)定蜂蜜氨基酸組成的研究

蟻碧珍 王錦源

摘 要：本文采用鹽酸水解法處理蜂蜜樣品，通過(guò)日立L-8900氨基酸分析儀分析6種不同品種蜂蜜的16種氨基酸。結(jié)果顯示：6種蜂蜜的總氨基酸含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，氨基酸組成基本一致，通過(guò)本方法檢測(cè)蜂蜜中氨基酸的含量，并可用于初步判斷蜂蜜中是否添加非蛋白成分。因此，氨基酸含量和氨基酸比值可為建立系統(tǒng)的氨基酸監(jiān)測(cè)技術(shù)體系提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蜂蜜;氨基酸;氨基酸分析儀

Abstract：Hydrochloric acid hydrolysis method was used to treat honey samples. Sixteen kinds of amino acids of six different varieties of honey were analyzed by Hitachi L-8900 amino acid analyzer. The results showed that the total amino acid content of six kinds of honey ranged from 0.106 7 to 0.194 9 g/100 g， and the amino acid composition was basically the same. The method of amino acid composition could be used to identify honey. Therefore， the content and ratio of amino acids can provide theoretical basis for the establishment of a systematic monitoring system of amino acids.

Key words：Honey; Amino acid; Automatic amino acid analyzer

中圖分類號(hào)：S896.1

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，經(jīng)自然發(fā)酵而成的黃白色黏稠液體，被譽(yù)為“大自然中最完美的原料與營(yíng)養(yǎng)食品”[1]。蜂蜜富含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，具有美容養(yǎng)顏、通便等生理功能。蜂蜜因其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與生理功能，越來(lái)越受到消費(fèi)者的追捧，近年來(lái)，許多不良商家為了降低蜂蜜的成本，增加利潤(rùn)，蜂蜜摻假現(xiàn)象越發(fā)嚴(yán)重。因此，有必要建立有效的手段對(duì)蜂蜜品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控。蜂蜜中蛋白質(zhì)和氨基酸含量與其營(yíng)養(yǎng)功能密切相關(guān)[3]。由于氨基酸是組成蛋白的基本單位，相同類型的物質(zhì)蛋白和氨基酸具有相似性，通過(guò)檢測(cè)蜂蜜中的氨基酸，分析其中的規(guī)律并建立質(zhì)控方法。本文采用氨基酸自動(dòng)分析儀設(shè)備測(cè)定不同產(chǎn)地蜂蜜中的氨基酸組成，該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、專一性強(qiáng)、可適用性強(qiáng)等特點(diǎn)[4-7]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：日立牌L-8900型號(hào)氨基酸自動(dòng)分析儀、HHS-2型號(hào)電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫干燥烘箱、AG204電子天平等。

試劑：濃鹽酸、茚三酮、苯酚等，均為分析純。

1.2 色譜條件

進(jìn)樣量20 μL，每個(gè)樣品分析時(shí)間約55 min。色譜柱規(guī)格：4.6×60 mm;填料：3 μm磺酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂分離柱;泵1流速：0.40 mL·min-1;泵2流速：0.35 mL·min-1;檢測(cè)器溫度：135 ℃;柱溫：57 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：第一通道570 nm，第二通道440 nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）的蜂蜜樣品于水解管中，加入6 mol·L-1的鹽酸10～15 mL，加入3～4滴新蒸餾苯酚，然后將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min，接著抽真空。將水解管接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近0 Pa），并充入高純氮?dú)?再抽真空然后充氮?dú)猓貜?fù)3次后，需在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口，將已封口的水解管放在（110±1）℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22 h后，取出冷卻。

打開(kāi)水解管，然后將水解液過(guò)濾后，水解管用去離子水多次沖洗，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶?jī)?nèi)，并用去離子水定容。吸取濾液2 mL于50 mL燒杯中，（標(biāo)明溫度）水浴蒸干，殘留物用1～2 mL水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次。最后通過(guò)混勻壓濾10 mL pH為2.2的緩沖液溶解，以供儀器測(cè)定用。

1.3.2 成分定量分析

制備上機(jī)測(cè)定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確吸取0.160 mL的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，然后用pH2.2的緩沖液稀釋到5 mL，該標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度為1.6 nmol/20 μL。以外標(biāo)法通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定試樣溶液的氨基酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、L-胱氨酸（L-Cystine）和L-絲氨酸（L-Cystine）18種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5 μmol·mL-1）160 μL加到5 mL的容量瓶中，再用0.02 mol·L-1鹽酸溶液進(jìn)行定容至刻度，運(yùn)用氨基酸分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析，用測(cè)出的峰面積以及濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程。其中16種氨基酸相關(guān)系數(shù)R2均為1.000 0。儀器噪音水平為224.3，其最低檢出限為0.70 pmol，見(jiàn)表1。

2.2 儀器精密度

由表2可知，將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成1.6 nmol/20 μL，然后連續(xù)進(jìn)樣6次，16種氨基酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.12%～1.15%，表明精密度良好，結(jié)果是符合該儀器要求。

2.3 試驗(yàn)方法的精密度

取適量的檢測(cè)蜂蜜樣品，按照1.3的方法處理，分別測(cè)定不同蜂蜜樣品的氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3。蜂蜜中氨基酸的平均回收率在91.0%～95.3%，RSD在0.00%～1.07%，均在允許范圍內(nèi)，結(jié)果較好。

2.4 蜂蜜中氨基酸成分分析

對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行酸水解，通過(guò)氨基酸分析儀對(duì)天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）和賴氨酸（Lys）16種氨基酸進(jìn)行測(cè)定，并算出總氨基酸含量。圖中脯氨酸用VIS2（440 nm）來(lái)檢測(cè)，除脯氨酸以外的其他氨基酸用VIS1（570 nm）來(lái)檢測(cè)（見(jiàn)圖1和圖2）。

由圖1可以看出，氨基酸分析儀在32 min內(nèi)能夠?qū)⒒鞓?biāo)中的16種氨基酸很好地分離。由圖2可以看出，蜂蜜待測(cè)液通過(guò)鹽酸水解后幾乎沒(méi)有雜質(zhì)干擾，各種氨基酸的分離效果良好，各氨基酸的峰形良好，且出峰時(shí)間與峰形和標(biāo)準(zhǔn)品比較一致。這說(shuō)明蜂蜜中各種氨基酸含量可以通過(guò)本法較準(zhǔn)確地獲得。對(duì)鹽酸水解后的6個(gè)蜂蜜樣品通過(guò)利用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，蜂蜜的氨基酸總含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，其中，苯丙氨酸的含量最高，為0.010 6～0.048 g/100 g;組氨酸的含量最低，為0.001 3～0.002 9 g/100 g;其他氨基酸的含量范圍為0.001 8～0.029 5 g/100 g，見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

6種蜂蜜的總氨基酸含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，可以通過(guò)本方法檢測(cè)蜂蜜中氨基酸的含量，并可用于初步判斷蜂蜜中是否添加非蛋白成分。由于正常蜂蜜中的氨基酸組成相對(duì)穩(wěn)定，蜂蜜中各氨基酸的比值可以作為判斷蜂蜜是否摻假的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳盛祿.中國(guó)蜜蜂學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[2]李欽龍.不同蜂蜜中蛋白質(zhì)的差異性研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[3]Won S，Lee D，Ko S H，et al.Honey major protein characterization and its application to adulteration detection[J].Food Research International，2008，41（10）：952-956.

[4]林潔茹，周華，賴小平.蜂蜜研究概述[J].中藥材，2006，29（1）：85-90.

[5]朱春紅，雍韋，徐厲，等.蜂蜜真假鑒定技術(shù)研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2007，19（3）：206-208.

[6]馮志強(qiáng)，許銀葉，黃永連，等.氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定膠原蛋白保健品中羥脯氨酸的含量[J].食品工業(yè)，2014，35（5）：248-250.

[7]林丹，莊俊鈺，黃永連，等.白蜂蜜的氨基酸指紋圖譜構(gòu)建及識(shí)別研究[J].食品工業(yè)，2014，36（7）：269-272.