辣木多糖除蛋白的工藝技術

初雅潔

摘 要：本文對辣木多糖除蛋白的工藝進行了研究，以辣木蛋白脫除率和多糖保留率為指標，比較三氯乙酸法、Sevage法、木瓜蛋白酶法的除蛋白效果，并采用單因素實驗優化木瓜蛋白酶法除蛋白的工藝。結果表明：木瓜蛋白酶法除蛋白工藝較簡單，且除蛋白的最佳工藝為酶解時間1.5 h、溫度60 ℃、pH=6.0時蛋白脫除率和多糖保留率均較高。

關鍵詞：辣木;多糖;除蛋白;工藝研究

Abstract：In this paper， the process of removing the protein of Spicywood Polysaccharide was studied， and the removal rate of Spicywood Polysaccharide and the protection of polysaccharide were studied. Compared with trichloroacetic acid， Sevage and papain， the single factor experiment was used to optimize the process of papain. The results showed that the protein was removed by papain enzyme. The process is simple， and the best process for protein removal is enzymatic hydrolysis time 1.5 h、temperature 60 ℃， pH=6.0， protein removal rate and polysaccharide retention rate are higher.

Key words：Spicewood; Polysaccharide; Deprotein; Process research

中圖分類號：R284.2

辣木（Moringa oleifera Lam.）起源于印度，屬于熱帶、亞熱帶多功能植物類別，并以常綠或者半落葉形態存在。因辣木葉片與果莢含各種礦物質以及維生素等使辣木已經成為人們重點關注與研究的植物類型。結合相關調查數據顯示，辣木在人體必需氨基酸的含量表現方面，明顯要比世界衛生組織推薦攝入標準高[1]。據資料顯示，辣木中的鈣元素含量及蛋白質含量遠比牛奶中的物質含量高得多，可高達4倍和2倍左右。其中，鉀元素含量比香蕉中的含量高出3倍左右、維生素A含量比胡蘿卜高出4倍左右。結合當前發展情況來看，辣木憑借自身豐富的營養價值已經被廣泛應用于醫療保健與飲食衛生領域當中，發展前景較為寬闊。

多糖物質一般廣泛存在于動植物以及微生物細胞壁中，是生物體重要生物分子之一。近些年來，隨著植物多糖的生物活性逐漸被人們認知，它憑借自身獨特活性以及低毒效應在醫療臨床應用中發揮了較大價值。但是多糖本身結構較為復雜且質量標準不易被控制，再加上部分多糖在天然產物中含量較低、不易被分離，導致多糖研究與臨床應用頻頻受阻。但從客觀角度上來看，我國多糖資源較為豐富，尤其是中草藥植物中的多糖成分較多，在開發潛力方面表現較為明顯。而辣木作為一種功能性植物，內部含有豐富的多糖物質，可以被應用于醫療保健與飲食衛生領域中，結合當前研究情況來看，關于辣木多糖的研究工作主要集中在提取工藝以及含量測定方面。對于辣木多糖分離純化工藝的研究內容相對較少。因此，本文研究工作主要以確定最佳的辣木多糖脫蛋白工藝為主，以期為辣木粗多糖分離純化提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

無水乙醇、辣木粗糖、蒸餾水、氯仿、正丁醇、木瓜蛋白酶、考馬斯亮藍、濃硫酸、苯酚等。

1.2 儀器與設備

分光光度計、便攜式酸度計、離心機、搖床機、數顯恒溫水浴鍋、pH計、海爾冰箱等。

1.3 研究方法

1.3.1 辣木多糖的提取

辣木粉→石油醚脫脂→80%乙醇回流提取兩次→熱水浸提→抽濾→減壓濃縮→無水乙醇沉淀→靜置過夜→無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→減壓干燥→辣木粗多糖[2-4]。

1.3.2 Sevage法除蛋白

取多糖樣液配成5%的水溶液，加入1/3體積的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）充分振搖10 min，離心分離15 min（4 000r·min-1），取上清液，重復上述步驟，測定蛋白和多糖吸光度[5]。

1.3.3 三氯乙酸法[6]

取多糖樣液50 mL，加入50 mL的3%三氯乙酸，使溶液均勻混合。于5～10 ℃冰箱中放置過夜，離心去除沉淀，測定蛋白和多糖的吸光度。

1.3.4 木瓜蛋白酶法

取10 mL多糖提取液，加入0.2 mL木瓜蛋白酶液（15 g·L-1），55 ℃酶解1.5 h，反應結束后沸水浴10 min，然后冷卻至室溫，4 000 r·min-1離心10 min后去除沉淀，測定蛋白和多糖吸光度[7]。

1.3.5 木瓜蛋白酶法除蛋白單因素試驗

（1）酶解時間對蛋白去除率的影響。分別取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，控制溶液中pH=6、酶解溫度為55 ℃。關于酶解時間的確定，可以分為設置為0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h。反應結束之后，需要將溶液沸水浴處理10 min。冷卻至室溫之后，以4 000 r·min-1的速度進行離心處理，處理結束后去除沉淀。并在此基礎上，對上清液蛋白濃度進行科學測定。

（2）酶解溫度對蛋白去除率的影響。分別提取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，控制溶液中pH=6。關于酶解溫度的控制，分別設置為50、55、60、65 ℃和70 ℃。反應結束之后，需要將其置于沸水浴當中，處理10 min后。將其冷卻至室溫。并在此基礎上，以4 000 r·min-1的離心速度去除沉淀。并對上清液蛋白濃度進行合理測量與分析。

（3）酶解pH對蛋白去除率的影響。分別提取10 mL多糖提取液，并向提取液中加入0.2 mL木瓜蛋白酶液。其中，將溶液pH值控制到3、4、5、6和7當中。將溶液置于55 ℃水浴酶解，酶解處理1.5 h之后，沸水浴10 min。冷卻至室溫之后，以4 000 r·min-1離心速度，處理10 min后去除沉淀。并在此基礎上，對上清液蛋白濃度進行合理測定。

2 結果與分析

2.1 Sevage法除蛋白

Sevage法是利用有機溶劑使溶液中的蛋白質變性而分離清除蛋白質，結果見圖1。由圖可知，脫蛋白4次后蛋白清除率基本穩定，多糖仍有少量下降，因此，最佳脫蛋白次數為4次。

2.2 三氯乙酸法除蛋白

三氯乙酸是酸性物質，能使蛋白質帶正電荷，并與負離子結合成不溶性的鹽類，結果見圖2。由圖可知，蛋白清除率隨著三氯乙酸脫蛋白次數的增加不斷升高，脫蛋白次數達到第4次時基本穩定，而多糖保留率仍在下降，因此，最佳脫蛋白次數為4次。

2.3 酶法除蛋白單因素實驗

2.3.1 酶解時間對蛋白清除率的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的延長蛋白清除率逐漸增大，但1.5 h之后蛋白清除率隨時間延長變化不明顯，多糖保留率隨酶解時間延長而降低，說明反應的最適時間為1.5 h左右。

2.3.2 酶解溫度對蛋白清除率的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白清除率逐漸增大，溫度達到60 ℃趨于穩定。而多糖保留率隨酶解溫度升高逐漸降低，說明該酶的最適反應溫度在60 ℃左右。

2.3.3 pH值對蛋白清除率的影響

隨著多糖溶液的pH值不同，酶對蛋白的清除率也會相應的發生變化，由圖5可知，pH=6時蛋白的清除率最大，隨后趨于穩定，多糖保留率卻逐漸下降，說明該酶的最適反應pH值為6。

綜上所述，酶法脫蛋白的最適pH為6、最適溫度為60 ℃、最適反應時間為1.5 h。

3 結論

研究發現，三氯乙酸法和Sevage法除蛋白工藝復雜，需要多次重復進行。綜合比較上述試驗結果，木瓜蛋白酶法更適用，且最佳工藝為酶解時間1.5 h、溫度60 ℃、pH=6.0，結合各項指標得出木瓜蛋白酶脫蛋白方法效果最好，為辣木多糖脫蛋白進一步研究提供了參考。

參考文獻：

[1]劉昌芬，李國華.辣木的研究現狀及其開發前景[J].云南熱帶作物科技，2002（3）：20-24.

[2]陳志慧.正交試驗法優選獼猴桃果水溶性多糖的提取工藝[J].河南工業大學學報（自然科學報），2005（3）：87-90.

[3]張國華，李紹平，季暉，等.正交設計優化冬蟲夏草多糖的提取工藝[J].安徽醫藥，2004（6）：404-405.

[4]張濤，馬海樂，鐘慧慧.分光光度法測定辣木多糖含量[J].糧油食品科技，2004（1）：32-33.

[5]張萍，賀茂萍，殷力，等.石榴皮多糖的Sevage法除蛋白工藝研究[J].食品科技，2013（12）2019-222.

[6]徐韌博，鄒攀，楊鑫.紅松松塔多糖三氯乙酸法脫蛋白工藝研究[J].中國甜菜糖業，2013（1）：5-8.

[7]楊輝，閆明明.響應面法優化酸性蛋白酶脫除大棗多糖蛋白工藝[J].糖食與油脂.2012，25（11）：49-52.