提取方法對青葉苧麻葉蛋白功能特性的影響

職士淇 王滿生 葉鳳凌 陳 龍 張曉婷邱浩楠 何 強 熊夏宇 董 怡

(1. 四川大學輕工科學與工程學院，四川 成都 610065; 2. 中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205; 3. 農業部麻類生物學與加工重點實驗室，湖南 長沙 410205; 4. 中山市第一職業技術學校，廣東 中山 528478)

隨著世界人口的劇增和生活水平的不斷提高，人類對蛋白質的需求量也越來越大，積極開發新的蛋白資源具有重要意義[1-2]。苧麻是中國傳統的纖維作物，生長快、產量高，其葉片約占植株質量的40%，苧麻葉還可食用[3]。青葉苧麻(Boehmerianiveavar. tenacissima)是白葉苧麻(BoehmerianiveaL. Gaud.)的變種[4]。孫延煒等[5]研究發現，青葉苧麻嫩莖葉粗蛋白含量比白葉苧麻的高3.75%，而粗纖維比白葉苧麻的低9.57%；其氨基酸含量較豐富，總氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分別較白葉苧麻的高20.71%，19.41%，且EAA/TAA為41%>40%，EAA/NEAA為69%>60%，被認為是優質植物蛋白源。此外，由于青葉苧麻葉片沒有白色絨毛，極易被高速刀片打碎而過篩，粉碎機的生產性能和度電產量也大大提高[6]。

超聲波輔助提取法由于操作簡捷、提取效率高、能維持提取物原有結構和活性等優點，已被廣泛用于輔助植物葉蛋白質的提取工藝研究，如桑樹葉蛋白的提取率達14%左右[7]；青豆蛋白的最佳提取率達42%左右[8]；辣木蛋白的最佳提取率為38%左右[9]；苧麻品種“中苧2號”的葉片蛋白質提取效率達11.26%[10]。作為蛋白質改性的手段之一，超聲處理還能提高蛋白質的部分功能特性[1,11]。根據蛋白的溶解特性，目前對植物蛋白的提取研究多采用堿溶液、鹽溶液和水為提取劑[7,12]。王滿生等[6]通過堿溶酸沉的方法提取青葉苧麻葉蛋白，其最佳葉蛋白溶出率達45.27%，最佳酸沉條件下葉蛋白溶出率達72.65%。

目前苧麻葉多為飼用，苧麻葉蛋白提取及功能特性等相關研究尚未見報道。研究擬以青葉苧麻葉片為研究對象，利用超聲波簡捷高效的優勢輔助提取青葉苧麻葉蛋白，探究堿溶液、鹽溶液和水對青葉苧麻葉蛋白質的提取效果及其乳化性、起泡性等功能特性的影響，以期為青葉苧麻中葉蛋白資源的有效開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青葉苧麻葉粉：過60目篩，中國農業科學院麻類研究所南方蛋白飼料植物資源開發與利用創新團隊；

福臨門大豆油：市售；

氯化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲基紅、溴甲酚綠：分析純，成都科隆化學品有限公司；

氫氧化鈉、硫酸銅、碘化鉀、硫酸鉀、硼酸、酒石酸鉀鈉、無水乙醇：分析純，成都金山化學試劑有限公司；

濃硫酸、鹽酸：分析純，西隴化工股份有限公司；

牛血清蛋白(BSA Albumin Fraction V)：純度>98%，德國Bio Froxx公司；

離心機：TG-1850型，四川蜀科儀器有限公司；

電子天平：ESJ210-4A型，沈陽龍騰電子有限公司；

多功能微孔板檢測儀：H1M型，美國BioTek Instruments公司；

消化爐：HYP-320型，上海纖檢儀器有限公司；

自動型定氮儀：KDN-19F型，上海纖檢儀器有限公司；

可調高速勻漿機：FSH-2A型，常州潤華電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 苧麻葉蛋白的提取 分別采用超聲波輔助堿溶液、鹽溶液和水溶液進行提取。提取工藝參照謝藝瀟等[7,12]的方法并適當修改。準確稱取1.5 g苧麻粉于不同離心管中，按料液比1∶20(g/mL)分別加入0.1 mmoL/L 的NaOH溶液、5%的NaCl溶液和蒸餾水，振蕩混勻， 150 W下超聲60 min，6 000 r/min離心20 min，取上清液，4 ℃冰箱保存備用。每種提取液均設置3個平行。

1.2.2 蛋白質含量的測定 參照周欣悅[13]的方法稍作修改。準確稱取牛血清蛋白溶解于蒸餾水中，分別配制成濃度為0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，7.50 mg/mL的溶液，與配制好的雙縮脲試劑以1∶4(體積比)混合，避光反應30 min，測定540 nm處吸光度，根據蛋白濃度和吸光度值計算得標準曲線方程Y=0.027 0X+0.099 2(R2=0.998 9)。

分別取適量堿提、鹽提、水提取的苧麻葉蛋白質溶液，用對應提取劑稀釋1倍，與雙縮脲試劑以1∶4(體積比)混合，避光反應30 min，測定540 nm處吸光度，通過標準曲線方程計算溶液中蛋白質濃度。

1.2.3 氮溶解指數(NSI)的測定 參照楊希娟等[14]的方法稍加修改。準確稱取苧麻粉末樣品0.5 g，共12份，其中3份不作任何處理，另外9份按1.2.2的方法進行蛋白提取，將提取后的殘渣于110 ℃下烘干，于消化管中將12份樣品分別與3.0 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅和20 mL濃硫酸混合，另取3支消化管分別加入3.0 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅、20 mL濃硫酸作空白試驗。樣品消化程序：200 ℃ 10 min，420 ℃ 120 min。分別取50 mL 2%的硼酸溶液和3滴甲基紅溴甲酚綠混合指示劑于250 mL錐形瓶，消化結束后待消化管冷卻至室溫，用自動型定氮儀進行定氮，用0.1 mol/L鹽酸溶液滴定。按式(1)計算氮溶解指數。

(1)

式中：

NSI——氮溶解指數，%；

P1——提取后殘渣中粗蛋白含量，g；

P——苧麻粉末樣品中粗蛋白含量，g。

1.2.4 起泡性及泡沫穩定性的測定 參照王一博等[15-16]的方法稍加修改。分別將堿提、鹽提、水提蛋白溶液稀釋至蛋白質含量為2 mg/mL，取稀釋后的溶液20 mL，10 000 r/min高速攪打2 min，然后迅速倒入量筒中，記錄上層泡沫體積和攪拌停止時蛋白質溶液體積，靜置30 min后，再次記錄上層泡沫的體積，分別按式(2)、(3)計算起泡性及泡沫穩定性。

(2)

(3)

式中：

FP——起泡性，%；

SF——泡沫穩定性，%；

V0——攪拌停止時上層泡沫體積，mL；

V1——攪拌停止30 min后泡沫體積，mL；

V2——攪拌停止時蛋白質溶液體積，mL。

1.2.5 乳化性及乳化穩定性的測定 參照葉鳳凌等[17-18]的方法稍加修改。取3 mL大豆油和9 mL已用對應提取溶劑稀釋至2 mg/mL的蛋白質溶液于50 mL塑料離心管內混合，10 000 r/min均質2 min，分別在0，30 min時從離心管底部5 mm處取16 μL乳狀液與4 mL 0.1%的SDS溶液混勻，測定500 nm處吸光值。分別按式(4)、(5)計算乳化性及乳化穩定性[19]。

(4)

(5)

式中：

EP——乳化性，m2/g；

SE——乳化穩定性；

D——稀釋倍數，取125；

c——蛋白溶液中蛋白質濃度，g/mL；

φ——乳化液中油相的體積分數，取0.25；

A0、A30——0，30 min時的吸光值；

Δt——兩次檢測的間隔時間。

1.3 數據處理

每組試驗重復3次，采用Office 2019、SPSS 19.0等軟件對試驗數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 對蛋白質溶液濃度的影響

由圖1可知，堿提、鹽提和水提得到的蛋白質量濃度分別為9.99，10.73，9.53 mg/mL，說明鹽提法得到的蛋白含量最高，堿提法次之，水提法最低。這主要是因為中性鹽中和了蛋白質表面的電荷并破壞了水化膜，使蛋白凝集沉淀，且蛋白質提取過程中低濃度中性鹽還可增加水的極性，進而使更多的蛋白質溶解至溶液中，最終提高了蛋白質提取率[20]。

2.2 對氮溶解指數的影響

由圖2可知，水提法、鹽提法和堿提法的氮溶解指數分別為56.96%，61.95%，55.09%，即鹽提法>水提法>堿提法，與雙縮脲法檢測的蛋白提取液中蛋白含量的結果趨勢相吻合。水提法和堿提法的青葉苧麻葉蛋白溶液的NSI值<60.00%，而鹽提法的蛋白溶液的NSI值略>60.00%，說明這3種方法均不能完全提取出青葉苧麻原料中的蛋白質，可能與植物蛋白組分有關。植物蛋白多含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白和殘渣蛋白，其中球蛋白在鹽溶液中溶解性較好，易被鹽提溶出；清蛋白可被蒸餾水提取；麥谷蛋白可用堿性溶液提取[20]，因此推測青葉苧麻葉片中球蛋白含量較高。此外，提取原料中蛋白質含量過高會影響蛋白提取率，如高蛋白豆粕提取后的殘渣蛋白明顯高于低蛋白豆粕，且更高的蛋白含量會導致分離蛋白提取率有所降低[21]。青葉苧麻葉粉中蛋白質含量約為28.89%，屬于高蛋白含量植物，故測得的樣品NSI值較低,符合上述原因分析。

圖1 提取方法對蛋白質溶液濃度的影響

2.3 對起泡性和泡沫穩定性的影響

由圖3可知，相比于10 mg/mL濃度條件下的大豆分離蛋白的起泡性只有10%[22]，青葉苧麻蛋白質表現出更佳的起泡性，且鹽提法蛋白質溶液的起泡性及泡沫穩定性均較佳。這可能是由于NaCl溶液可以與蛋白質發生相互作用，影響蛋白質的黏度、展開和聚集，進而對起泡性產生一定的影響[23]。同時，一定量的NaCl所提供的離子環境還可以增大蛋白質的溶解度，降低在氣—液界面上未吸附蛋白質與吸附蛋白質之間的排斥力，有助于蛋白質吸附在泡沫的界面上而防止泡沫粗化，從而增強蛋白質溶液的起泡性和泡沫穩定性[24]。

由圖3還可知，相比于水提法，堿提法蛋白質溶液的起泡性稍差，但其泡沫穩定性稍好，可能是水提法溶液的pH值更接近蛋白質的等電點，由于缺乏在界面和吸附分子之間的排斥力，被吸附到界面上的蛋白質數量增加，提高了蛋白質的起泡性，而堿提法的pH值略高，排斥作用降低，促進界面上蛋白質之間的相互作用形成黏度較大的膜，從而表現得更加穩定[25-26]。

2.4 對乳化性和乳化穩定性的影響

由圖4可知，3種蛋白質溶液的乳化性分別為5.89，5.27，11.17 m2/g，其中水提法蛋白質的乳化性效果最好，而鹽提法的乳化性效果不佳。3種蛋白質溶液的乳化穩定性分別為231.92，114.26，145.65。由于蛋白質的乳化性受溶解性和表面活性兩個因素影響，堿提法的蛋白質提取液pH值有所升高，遠離等電點，而遠離等電點時蛋白質的溶解度增大，參與乳化作用的蛋白質也隨之增多，因此堿提法蛋白質溶液有較好的乳化性及乳化穩定性[27]。而鹽提法蛋白質溶液，其乳化性和乳化穩定性均比另外兩種提取方法有一定程度的降低，這一情況與鄧塔等[28]的結果類似。這可能是鹽溶液中的離子破壞了乳狀液中液滴表面電荷平衡，液滴間無法保持平衡，乳化穩定性減小。當食鹽濃度≥0.5 mol/L時，可能會促進脂肪之間的加速融合，從而降低蛋白質溶液的乳化穩定性[29]。

圖2 提取方法對NSI值的影響

圖3 提取方法對蛋白質起泡性和泡沫穩定性的影響

圖4 提取方法對蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

3 結論

研究了超聲波輔助堿溶液、鹽溶液和水對青葉苧麻葉蛋白的提取效果。結果表明，低濃度的中性鹽溶液可增加水的極性，從而促進蛋白質的溶解并提高其提取率，根據植物蛋白組分的溶解特性，推測青葉苧麻葉片中球蛋白含量較高。青葉苧麻葉蛋白含量約為28.89%，3種溶劑提取的蛋白質的氮溶指數均較低，且鹽提法(61.95%)>水提法(56.96%)>堿提法(55.09%)。3種提取法的青葉苧麻葉蛋白的起泡性均優于10 mg/mL濃度條件下的大豆分離蛋白的起泡性(10%)，且鹽提法的青葉苧麻葉蛋白的起泡性及泡沫穩定性均優于其他兩種提取方法。后續可進一步明確青葉苧麻葉蛋白組分的結構和功能性質，為青葉苧麻葉的開發利用提供更多的理論依據。