模擬胃腸消化對牡蠣低聚肽抗氧化活性的影響

馬 勇 高麗輝 馮曉文谷瑞增 韓 濤 劉文穎

(1. 浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315832；2. 中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；3. 北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100015；4. 北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206)

牡蠣(Ostrea)又名生蠔，是世界上第一大養殖貝類，是中國四大養殖貝類之一。牡蠣營養價值高，蛋白質含量高，氨基酸含量豐富且均勻，有“海洋牛奶”之稱。通過生物酶解、分離純化、噴霧干燥等技術制備牡蠣肽，是牡蠣高值化利用的有效途徑[1-2]。研究[3-6]表明，牡蠣肽具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和抑制ACE活性等生理作用。

牡蠣低聚肽主要成分為短肽，相對分子量小。與氨基酸相比，人體對短肽的吸收利用率更高且不易飽和，例如二肽和三肽的吸收速度高于相同組成的氨基酸[7]。但經口服進入人體后，受胃腸道中各種消化酶的作用，可能會造成生物活性的降低[8-9]。目前，關于牡蠣低聚肽消化前后抗氧化活性的研究未見報道。

研究擬以去殼牡蠣肉為原料，經蛋白提純、酶解、分離純化等步驟制得牡蠣低聚肽，采用胃蛋白酶和胰蛋白酶對其進行體外模擬消化，通過對比消化前后牡蠣低聚肽分子量分布、DPPH自由基清除能力、羥自由基(·OH)清除能力、ABTS自由基清除能力以及氧自由基吸收能力(ORAC)變化，驗證牡蠣低聚肽消化前后抗氧化能力的變化，以期為牡蠣低聚肽在抗氧化功能性食品的開發方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍去殼牡蠣肉：北京中食海氏生物技術有限公司；

堿性蛋白酶(≥4.0×105DU/g)、中性蛋白酶(≥1 600 AU/g)：杜邦丹尼斯克公司；

胃蛋白酶：≥250 Units/mg，美國Sigma公司；

胰蛋白酶：≥250 NFU/mg，美國Solarbio公司；

偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、Fluorescein(熒光指示劑)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、Trolox(水溶性維生素E)、分子量標準品：分析純，美國Sigma公司；

乙腈、三氟乙酸：色譜純，美國Fisher公司；

ABTS自由基清除率檢測試劑盒：碧云天生物技術研究所；

其他試劑：分析純，北京化工廠；

恒溫水浴鍋：HH-501型，常州國宇儀器制造有限公司；

電子天平：SI-114型，美國Denver Instrument公司；

噴霧干燥機：GZ-5型，無錫市陽光干燥設備廠；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9075A型，北京陸希科技有限公司；

多功能酶標儀：Spectra MR型，美國Dynex公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本Shimadzu公司；

多功能酶標儀：SpectraMax i3x型，美國MD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡蠣低聚肽的制備 將冷凍去殼牡蠣肉先用蒸餾水洗凈，然后稱取600 g絞碎，加入蒸餾水攪拌成勻漿。控溫(50±2) ℃，調節pH至8.5，以每克原料2 500單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2 h，使用0.1 mol/L的HCl調節水解液pH為6.5，以每克原料3 000單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h。酶解過程中用0.1 mol/L的HCl或NaOH調節水解液使pH保持不變。酶解結束后，100 ℃沸水浴滅酶，10 000×g下離心20 min，取上清液，利用孔徑為200 nm的陶瓷膜進行過濾，取濾過清液，再用超濾膜超濾(截留分子量1 000 Da)，取分子量<1 000 Da 的濾過液進行噴霧干燥，進料溫度25 ℃，進料速度14 mL/min，進風溫度135 ℃，進風壓力20 kPa，制備出牡蠣低聚肽干粉。

1.2.2 牡蠣低聚肽體外模擬消化

(1) 體外模擬胃液消化試驗：準確稱取5.0 g牡蠣低聚肽和0.2 g NaCl加入到50 mL去離子水中，用1.0 mol/L 的HCl調節pH至2.0，37 ℃水浴，加入0.05 g胃蛋白酶消化2 h，消化完畢后100 ℃沸水浴滅酶，待冷卻至室溫，用1.0 mol/L NaOH溶液將pH調至7.5，最后定容至100 mL。空白對照同上述處理方法，不加胃蛋白酶[10-12]。

(2) 體外模擬腸液消化試驗：準確稱取5.0 g牡蠣低聚肽和0.68 g KH2PO4加入到50 mL去離子水中，用濃度為1.0 mol/L NaOH將pH調至7.5，37 ℃水浴，加入0.05 g 胰蛋白酶恒溫消化4 h，消化完畢后100 ℃沸水浴滅酶，冷卻至室溫后，加去離子水定容至100 mL。空白對照同上述處理方法，不加胰蛋白酶[10-12]。

1.2.3 分子量分布的測定 采用反相高效液相凝膠色譜法進行分子量分布分析。流動相：乙腈—水—三氟乙酸(V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=45∶55∶0.1)；色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流速：0.5 mL/min；樣品濃度：1.0 mg/mL；進樣體積：10 μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃。用孔徑0.2 μm的聚四氟乙烯濾膜將樣品溶液過濾后，上機進行凝膠過濾。將乙氨酸—乙氨酸—乙氨酸、乙氨酸—乙氨酸—酪氨酸—精氨酸、桿菌酶和細胞色素C配制成0.1 g/100 mL的溶液，用于制作相對分子量標準曲線[13]。

1.2.4 牡蠣低聚肽消化前后的DPPH自由基清除率測定

依次加入100 μL 0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液和100 μL不同濃度的樣品溶液，室溫避光放置30 min，于517 nm處測定吸光值；將100 μL不同濃度的樣品溶液與100 μL無水乙醇混合，測定吸光值；以蒸餾水代替樣品作為空白對照，與100 μL 0.1 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混合，測定吸光值[14]。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

S——自由基清除率，%；

Ax——樣品組吸光值；

A0——空白組吸光值；

A1——對照組吸光值。

1.2.5 牡蠣低聚肽消化前后的·OH清除率測定 采用水楊酸法，其原理是H2O2和Fe2+反應生成·OH，再加入水楊酸后能夠捕捉·OH顯色。依次加入100 μL不同濃度的樣品溶液，200 μL 5 mmol/L水楊酸—乙醇溶液，200 μL 5 mmol/L FeSO4溶液，試驗組以100 μL 5 mmol/L H2O2啟動反應；對照組以等體積蒸餾水啟動反應。空白組以等體積蒸餾水代替樣品。渦旋震蕩，反應1 h后取200 μL反應液在510 nm處測定吸光值[15]。按式(1)計算·OH清除率。

1.2.6 牡蠣低聚肽消化前后的ABTS自由基清除率測定

將2.45 mmol/L高硫酸鉀溶液加入到7 mmol/L ABTS儲備液中，室溫避光靜置16 h，制備成ABTS+自由基儲備液。用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)將ABTS+自由基儲備液稀釋35倍后作為工作液。每個孔中加入200 μL稀釋35倍的工作液。向標準曲線檢測孔中加入10 μL不同濃度的Trolox(水溶性維生素E)標準溶液，向樣品檢測孔中加入樣品10 μL，輕輕混勻后室溫孵育6 min，于734 nm處測定吸光值。同時制作Trolox溶液標準曲線，最終樣品的抗氧化能力以mmol/g Trolox表示[16]。

1.2.7 牡蠣低聚肽消化前后的ORAC值測定 將25 μL樣品溶液和100 μL的Fluorescein(熒光指示劑，0.8 μmol/L)于96孔板中混合，然后加入75 μL 150 mmol/L 偶氮類化合物AAPH啟動反應，此為試驗組。分別用25 μL Trolox標準品(6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，250.00，500.00 μmol/L)代替樣品作為陽性對照(制作標準曲線)、25 μL磷酸緩沖液(pH 7.4，75 mmol/L)代替樣品為空白對照，于37 ℃保溫20 min，熒光酶標儀激發波長485 nm，發射波長530 nm，每隔2 min 測定一次，測定150 min。同時以磷酸緩沖液代替AAPH作為對照。以樣品和標準品的熒光衰退曲線的保護面積之比計算樣品的ORAC值，結果表示為μmol/g Trolox[17-18]。

1.2.8 數據處理 試驗平行測定3次，結果以平均值±標準偏差表示。使用Origin 8.0軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 消化前后牡蠣低聚肽分子量分布

分子量分布分析結果(表1)表明，牡蠣低聚肽的分子量主要在1 000 Da以下，占總比例的89%以上，具有較好的水溶性、消化吸收性。研究[19]表明，肽的抗氧化作用與其分子量大小有關，分子量低的短肽往往表現出較高的抗氧化活性。因此，牡蠣低聚肽是一種具有潛力的天然抗氧化性物質。胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，牡蠣低聚肽的重均分子量略微減少，這是由于低聚肽經蛋白酶消化后，部分肽段會被酶切降解，進一步生成小肽，將一些活性基團暴露出來，增加低聚肽與自由基發生反應的機會[20]。但是消化前后重均分子量變化不超過8.2%，因此牡蠣低聚肽具有一定的消化穩定性。

2.2 消化前后牡蠣低聚肽的DPPH自由基清除能力

在體外模擬胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后，牡蠣低聚肽對DPPH自由基清除能力的變化如圖1所示。由圖1可知，在濃度為1～20 mg/mL時，消化前后的牡蠣低聚肽對DPPH自由基清除率與濃度呈明顯的劑量關系。與消化前相比，消化后的牡蠣低聚肽對DPPH自由基清除能力稍有下降。胃蛋白酶消化前后，IC50值分別約為6.1，7.8 mg/mL，在試驗濃度范圍內，最高降低7.9%；胰蛋白酶消化前后，IC50值分別約為6.3，6.6 mg/mL，最高降低8.7%。但胃腸消化對DPPH自由基清除能力均無顯著性影響(P>0.05)。因此，經模擬消化后，牡蠣低聚肽仍可保持較高的抗氧化活性。王熙等[21]的研究中也報道了相似的結果，條滸苔抗氧化肽模擬胃腸消化后，其DPPH自由基清除能力稍有下降，但沒有顯著性影響。

2.3 消化前后牡蠣低聚肽的·OH清除能力

經胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后牡蠣低聚肽對·OH清除能力的變化如圖2所示。牡蠣低聚肽的·OH 清除能力在試驗濃度范圍內呈濃度依賴趨勢。徐兆剛等[22]制備的河蚌蛋白肽在濃度31.32 mg/mL時，·OH 清除率為82.29%，低于試驗中牡蠣低聚肽的·OH 清除率。胃蛋白酶消化前后，濃度6 mg/mL時·OH 清除率變化最大，降低9.3%，在8～15 mg/mL范圍內，牡蠣低聚肽的·OH清除能力與未處理的基本相同，消化前后IC50值分別約為8.1，8.3 mg/mL。胰蛋白酶消化前后，整體·OH清除能力較胃蛋白酶處理更加穩定，濃度4 mg/mL時·OH清除率變化最大，降低3.8%，其余濃度下變化很小，消化前后IC50值分別約為5.9，6.0 mg/mL。胃腸消化對·OH清除能力均無顯著性影響(P>0.05)，說明牡蠣低聚肽在·OH清除能力方面具有一定的消化穩定性，可能是具有·OH清除能力的肽類因其結構不符合消化酶的特異要求從而能夠抵抗消化酶水解，使整體保持較高的抗氧化活性[21]。

表1 不同處理的牡蠣低聚肽分子量分布

圖1 不同處理的牡蠣低聚肽對DPPH自由基清除作用

2.4 消化前后牡蠣低聚肽的ABTS自由基清除能力

以Trolox標準品繪制的ABTS標準曲線如圖3所示，根據標準曲線計算消化前后牡蠣低聚肽的ABTS自由基清除率，結果如表2所示。胃腸消化對ABTS自由基清除能力均無顯著性影響(P>0.05)，胃蛋白酶消化后，牡蠣低聚肽對ABTS自由基的清除能力降低了9.2%；胰蛋白酶消化后，對ABTS自由基的清除能力提高了3.6%。這與Schmelzer等[23]研究的β-酪蛋白和劉珊珊等[20]研究的酪蛋白肽經模擬胃腸消化后的降解規律一致。推測是由于胃蛋白酶將部分高活性肽段酶切降解，阻礙了低聚肽與ABTS自由基的反應，使低聚肽對自由基的清除能力略有下降。在隨后的模擬腸道消化階段，胰蛋白酶消化后，進一步生成小肽，暴露更多活性基團，大大增加與ABTS自由基反應的機會，從而增強對自由基的清除能力[24]。

圖2 不同處理的牡蠣低聚肽對·OH清除作用

圖3 ABTS標準曲線

表2 不同處理的牡蠣低聚肽對ABTS自由基清除作用

2.5 消化前后牡蠣低聚肽的ORAC值

不同濃度Trolox繪制標準曲線如圖4所示，根據標準曲線計算最終牡蠣低聚肽消化前后的ORAC值變化，結果如表3所示。胃腸消化對牡蠣低聚肽的ORAC值均無顯著性影響(P>0.05)，經胃蛋白酶消化后，ORAC值提高了11.5%；經胰蛋白酶消化后，ORAC值提高了1.3%。顧敏[25]對青養蛋白抗氧化肽經凝膠過濾色譜分離的組分B的胃腸道消化特性進行了研究，結果與試驗一致，體外胃腸道消化體系均提高了其抗氧化活性。產生這種結果可能是因為經胃、胰蛋白酶處理后，牡蠣低聚肽的部分肽段被酶解，生成小肽段(三肽或二肽)和氨基酸，而某些分子量越小的肽段抗氧化活性越強[19]。另據報道[24]，某些氨基酸，如蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸等，因其特殊的結構而具有抗氧化作用。這些都可能是牡蠣低聚肽消化之后ORAC值提高的原因。

圖4 Trolox標準曲線

表3 不同處理的牡蠣低聚肽的ORAC值變化

3 結論

試驗以去殼牡蠣肉為原料，通過兩步酶解法制備牡蠣低聚肽，并以其為研究對象，模擬胃腸道消化試驗，通過對比體外消化前后的分子量分布、DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、ABTS自由基清除能力和ORAC值，探討胃腸道消化對其抗氧化活性的影響。結果表明，牡蠣低聚肽的相對分子量主要在1 000 Da以下，胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后重均分子量下降不超過8.2%；胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，DPPH自由基清除率降低分別不超過7.9%，8.7%；胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，·OH清除率降低分別不超過9.3%，3.8%；胃蛋白酶消化后，ABTS自由基清除率降低9.2%，胰蛋白酶消化后，ABTS自由基清除率提高3.6%；胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，ORAC值分別提高11.5%，1.3%。胃腸消化對牡蠣低聚肽的抗氧化活性評價各指標均無顯著性影響(P>0.05)，證明牡蠣低聚肽經模擬胃腸道消化后仍保持較高的抗氧化活性，個別抗氧化評價指標有所提高。這表明牡蠣低聚肽具有較好的綜合抗氧化活性和穩定性，此外，由于牡蠣低聚肽具有很高的安全性，長期食用不會產生毒副作用，因此可用于抗氧化功能性食品的開發應用。后續將通過凝膠色譜、離子交換色譜、反相高效液相色譜等方法分離篩選高活性的抗氧化肽片段，進一步探討牡蠣低聚肽發揮抗氧化作用的機理和具體功效成分。