干芥菜接種發(fā)酵發(fā)酵劑優(yōu)化

李文青 羅鳳蓮,2,3 卿 泉 蔣依琳

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128； 2. 國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖南 長沙 410128； 3. 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

芥菜是中國著名蔬菜之一[1]，其營養(yǎng)價值、藥用價值較高[2-3]。芥菜腌制發(fā)酵后有特殊鮮味和香味，但因其顯著的季節(jié)性，且加工產(chǎn)品含鹽量較高，加之發(fā)酵后的漂洗脫鹽工序使產(chǎn)品損失了部分色、香、味[4-5]。劉大群等[6]分析了不同脫水方式腌制的蕭山蘿卜干的揮發(fā)性成分，采用傳統(tǒng)風(fēng)脫水方式腌制的蘿卜干的揮發(fā)性香氣成分種類多，且相對含量高于采用鹽脫水方式腌制的蘿卜干。以干芥菜為原料進(jìn)行發(fā)酵可以保證原料的供應(yīng)，降低產(chǎn)品含鹽量，產(chǎn)品品質(zhì)較高。目前，發(fā)酵芥菜的制作方式以自然發(fā)酵為主，但接種發(fā)酵能顯著縮短發(fā)酵時間和提升產(chǎn)品品質(zhì)[7-8]。敖曉琳等[9]研究表明，接種發(fā)酵能改善泡菜的口感；云琳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵泡菜的果糖、塔格糖和蔗糖含量高，其氣味、滋味和總分均最高；同時，在卷心菜的發(fā)酵初期接種彎曲乳酸菌可降低發(fā)酵卷心菜中酪胺含量[11]。王一淇[12]從湖南自然發(fā)酵芥菜中篩出適合芥菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌：腸系膜明串珠菌 (Leucofiostocmesenteroides，LM)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)和戊糖片球菌(Pediococcupentosaceus，PP)。試驗擬通過對這3種菌的生長曲線、產(chǎn)酸能力、耐鹽性、耐溫性及pH值適應(yīng)性進(jìn)行測定，選出適合干芥菜發(fā)酵的菌株，然后通過優(yōu)勢菌群構(gòu)建和配比優(yōu)化試驗，對發(fā)酵干芥菜的發(fā)酵劑進(jìn)行優(yōu)化。旨在為發(fā)酵干芥菜產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干芥菜：水分含量14.4%，福建泉州；

食鹽：市售；

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)CICC-21861、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ATCC-8014、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)CICC-22737：廣東省微生物菌種保藏中心；

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硼酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、甲醛、硫酸等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

改良MRS 培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司；

干芥菜培養(yǎng)基：將干芥菜復(fù)水洗凈切碎，復(fù)水芥菜與蒸餾水以質(zhì)量比1∶1的比例混勻打漿過濾，加入1%蛋白胨、2%葡萄糖，調(diào)節(jié)pH 6.8，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻，自制。

1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：TP-620A型，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；

可見分光光度計：V-5000型，上海原析儀器有限公司；

高溫滅菌鍋：YXQ-SG46-280S型，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；

單人單面凈化工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

全自動細(xì)菌生長測定儀：RTS-1型，上海怡賽科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干芥菜加工工藝流程及操作要點

干芥菜復(fù)水清洗→瀝干→切分→添加食鹽和發(fā)酵劑→混勻裝瓶→密封發(fā)酵→成品

(1) 復(fù)水清洗瀝干：干芥菜和水以質(zhì)量比1∶20復(fù)水30 min，清洗，瀝干10 min。

(2) 接種發(fā)酵劑：以復(fù)水芥菜為基準(zhǔn)，將制備好的發(fā)酵劑按相應(yīng)的種類和比例接種至復(fù)水芥菜中。

(3) 添加食鹽：以復(fù)水芥菜為基準(zhǔn)，加入8%的食鹽。

(4) 密封發(fā)酵：拌勻后裝入玻璃瓶中密封，37 ℃恒溫發(fā)酵。

1.3.2 菌種的活化 將安碚管用酒精棉片擦拭消毒，用酒精燈加熱安碚管的凹陷封口處，封口處使用無菌吸管滴1～2滴無菌水使安碚管破裂，用無菌吸管吸取0.5 mL無菌水于管中，待干粉全部溶解，接種于5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h，連續(xù)轉(zhuǎn)管活化2次后取幾滴轉(zhuǎn)接至試管斜面上保藏菌種。

1.3.3 生長曲線的測定 將斜面上的菌種用MRS肉湯培養(yǎng)基轉(zhuǎn)管活化2代，活化后的菌株分別按體積分?jǐn)?shù)5%接種至MRS肉湯培養(yǎng)基和芥菜培養(yǎng)基中(100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中加入5 mL活化后的菌種)，混勻，用全自動細(xì)菌生長測定儀測定OD850 nm值，以時間為橫坐標(biāo)，OD850 nm值為縱坐標(biāo)，繪制各菌株生長曲線圖。

1.3.4 產(chǎn)酸能力的測定 將活化2次的菌株按體積分?jǐn)?shù)5%接種至已滅菌的芥菜培養(yǎng)基中，混勻，取少量樣品作為0 h樣品，測定pH值，將各菌株于37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h取樣、測定，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)，繪制各菌株的產(chǎn)酸曲線圖。

1.3.5 耐鹽性的測定 用食鹽調(diào)節(jié)芥菜培養(yǎng)基的含鹽量，使其食鹽濃度分別為0%，2%，4%，6%，8%，10%，12%，將3種菌株按體積分?jǐn)?shù)5%接種至上述芥菜培養(yǎng)基中，混勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)，用全自動細(xì)菌生長測定儀測定第36 h的OD850 nm值。

1.3.6 耐溫性的測定 將菌株按體積分?jǐn)?shù)5%接種至芥菜培養(yǎng)基中，混勻，分別于17，22，27，32，37，42，47 ℃恒溫培養(yǎng)，用全自動細(xì)菌生長測定儀測定第36 h 的OD850 nm值。

1.3.7 pH適應(yīng)能力的測定 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)芥菜培養(yǎng)基，使其pH值分別為3，4，5，6，7，8，9，將菌株按體積分?jǐn)?shù)5%接種至芥菜培養(yǎng)基中，混勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)，用全自動細(xì)菌生長測定儀測定第36 h 的OD850 nm值。

1.3.8 發(fā)酵劑的制備 按1.3.1活化菌種后，按接種量5%擴(kuò)大集中培養(yǎng)50 mL，在菌種的對數(shù)生長期進(jìn)行離心分離(4 000 r/min，20 min)，去除液體培養(yǎng)基，用50 mL 0.85% 的生理鹽水洗滌菌懸液，制成發(fā)酵劑備用(菌濃度為108CFU/mL)。

1.3.9 優(yōu)勢菌群構(gòu)建及其配比優(yōu)化

(1) 優(yōu)勢菌群構(gòu)建：參照洪冰[13]的方法，按表1將各菌株接種至鹽度為8%的復(fù)水芥菜中，以自然發(fā)酵為對照組，37 ℃下發(fā)酵，每3 d測定各發(fā)酵產(chǎn)品的總酸、亞硝酸鹽、氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)酯含量，并進(jìn)行感官評價。

(2) 發(fā)酵菌株的配比優(yōu)化：參照王巧[14]的方法，按表2 進(jìn)行發(fā)酵菌株的配比優(yōu)化。按3%的接種量接種至鹽度為8%的復(fù)水芥菜中，37 ℃下發(fā)酵，每3 d測定發(fā)酵產(chǎn)品的總酸、亞硝酸鹽、氨基酸態(tài)氮和揮發(fā)酯含量，并進(jìn)行感官評價。

表1 優(yōu)勢菌群構(gòu)建

表2 發(fā)酵菌株配比優(yōu)化

1.3.10 指標(biāo)測定

(1) 總酸：參照文獻(xiàn)[15]。

(2) 亞硝酸鹽：按GB 5009.33—2016執(zhí)行。

(3) 揮發(fā)酯含量：按GB/T 11857—2008執(zhí)行。

(4) 氨基酸態(tài)氮含量：按GB 5009.235—2016執(zhí)行。

(5) 感官評分：參照表3，分別從色澤(25分)、質(zhì)地(25分)、香氣(25分)、滋味(25分)4個方面進(jìn)行感官評分，總分100分，結(jié)果取平均值。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理及分析 采用SPSS 23軟件進(jìn)行顯著性檢驗分析，P<0.05為顯著性水平，采用Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株性質(zhì)

2.1.1 MRS肉湯培養(yǎng)基生長曲線 由圖1可知，腸膜明串珠菌和戊糖片球菌的適應(yīng)期大于植物乳桿菌；植物乳桿菌于培養(yǎng)5 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，5～13 h生長旺盛，13 h 后進(jìn)入穩(wěn)定生長期；腸膜明串珠菌與戊糖片球菌的生長曲線類似，于培養(yǎng)10 h時進(jìn)入對數(shù)生長期，10～20 h生長旺盛，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期；3株菌株的最終OD850 nm值均為4.00左右，其中腸膜明串珠菌的OD850 nm值最高，為4.25。

表3 感官評定標(biāo)準(zhǔn)

圖1 菌株的MRS肉湯培養(yǎng)基生長曲線

2.1.2 芥菜培養(yǎng)基生長曲線 由圖2可知，與MRS培養(yǎng)基相比，3株菌株在芥菜培養(yǎng)基中的起酵時間延長，可能是菌株接種至新環(huán)境后需要一定時間重新合成必需的酶類、輔酶或者其他中間產(chǎn)物；植物乳桿菌于培養(yǎng)12 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，12～20 h生長旺盛，腸膜明串珠菌于培養(yǎng)18 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，18～28 h生長旺盛，最終OD850 nm值穩(wěn)定在1.78，戊糖片球菌于培養(yǎng)19 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，19～27 h生長旺盛；3種菌株在芥菜培養(yǎng)基中最終的OD850 nm值小于MRS肉湯培養(yǎng)基中，可能是干芥菜復(fù)水后的營養(yǎng)物質(zhì)與MRS肉湯培養(yǎng)基存在差異。

2.1.3 產(chǎn)酸能力 由圖3可知，3株菌株的pH值隨發(fā)酵時間的延長呈下降趨勢，并緩慢趨于穩(wěn)定。菌株的產(chǎn)酸能力變化規(guī)律與其生長曲線相關(guān)，發(fā)酵前期環(huán)境條件適宜，其生長代謝較快，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)；發(fā)酵后期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗，同時培養(yǎng)基pH值的降低抑制了菌株的生長，使得pH值趨于平穩(wěn)[16]。3株菌株的產(chǎn)酸能力均較強(qiáng)，培養(yǎng)36 h后pH穩(wěn)定于4左右。

2.1.4 耐溫能力 由圖4可知，菌株的OD850 nm值隨發(fā)酵溫度的增加呈先增長后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為17 ℃ 時，因溫度較低，乳酸菌的生長代謝活動很慢，3株菌株的吸光度都較低；隨著發(fā)酵溫度的升高，3株菌株的OD850 nm值不斷升高；溫度過高，微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝都受到影響，所以各菌株的OD850 nm值隨之下降，當(dāng)發(fā)酵溫度為47 ℃時，3株菌株幾乎不生長。腸膜明串珠菌的最適生長溫度為32 ℃，其OD850 nm值為1.67；植物乳桿菌和戊糖片球菌的最適生長溫度為37 ℃，其OD850 nm值分別為1.30，1.54。

圖2 菌株的芥菜培養(yǎng)基生長曲線

圖3 菌株的產(chǎn)酸曲線

同一菌株字母不同表示不同溫度之間具有顯著性差異(P<0.05)

2.1.5 耐鹽能力 由圖5可知，3株菌株的OD850 nm值隨食鹽濃度的增大而下降；當(dāng)食鹽濃度為0%時，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌的OD850 nm值最高，分別為1.60，1.25，1.50；當(dāng)食鹽濃度為12%時，3株菌株都停止生長，故在發(fā)酵芥菜中，食鹽含量不宜超過12%。

2.1.6 pH值適應(yīng)能力 由圖6可知，3株菌株的OD850 nm值隨pH值的升高呈先升高后下降的趨勢，pH值過高或過低都會抑制菌株的生長；腸膜明串珠菌和植物乳桿菌的最適生長pH值為6，其OD850 nm值分別為1.67，1.27；戊糖片球菌的最適生長pH值為7，其OD850 nm值為1.49。

2.2 優(yōu)勢菌群的建立

2.2.1 對總酸含量的影響 由圖7可知，發(fā)酵干芥菜的總酸含量隨發(fā)酵時間的增加而上升，并于發(fā)酵后期逐漸平穩(wěn)。乳酸菌利用原料發(fā)酵產(chǎn)酸，總酸含量逐漸上升，發(fā)酵后期，發(fā)酵液pH值較低，乳酸菌群的活動受到抑制。總酸含量在發(fā)酵第3～9天上升較快；從第6天開始，3種菌混合發(fā)酵的樣品總酸含量高于其他組，發(fā)酵18 d后，3種菌混發(fā)酵的樣品總酸含量達(dá)(0.97±0.016)%，顯著高于其他樣品(P<0.05)；3種菌混合發(fā)酵時產(chǎn)酸較快，發(fā)酵產(chǎn)品總酸含量最高。

同一菌株字母不同表示不同含鹽量之間具有顯著性差異(P<0.05)

同一菌株字母不同表示不同pH值之間具有顯著性差異(P<0.05)

同一發(fā)酵天數(shù)字母不同表示不同樣品之間具有顯著性差異(P<0.05)

同一發(fā)酵天數(shù)字母不同表示不同樣品之間具有顯著性差異(P<0.05)

2.2.3 對氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖9可知，發(fā)酵干芥菜的氨基酸態(tài)氮含量隨發(fā)酵時間的增加呈先上升后略有下降的趨勢，可能是原料中的蛋白質(zhì)通過相關(guān)酶和微生物的作用被分解為氨基酸，使得初期氨基酸態(tài)氮含量不斷增加，發(fā)酵后期，發(fā)酵液中的鹽分提高了細(xì)胞液的滲透壓，芥菜細(xì)胞被破壞，一些游離氨基酸隨細(xì)胞滲透到泡菜液中被微生物利用，產(chǎn)品中氨基酸態(tài)氮含量減少[19-20]。發(fā)酵第3～9天氨基酸態(tài)氮含量上升速度較快，發(fā)酵9 d后，3種菌混合發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量顯著高于其他組(P<0.05)，其含量為0.103%～0.112%，其他接種發(fā)酵的干芥菜之間無顯著性差異(P>0.05)。說明接種不同的菌種對發(fā)酵干芥菜的氨基酸態(tài)氮含量有較大影響，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌同時使用時，氨基酸態(tài)氮含量較高，發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)較好。

2.2.4 對揮發(fā)酯含量的影響 由圖10可知，發(fā)酵干芥菜的揮發(fā)酯含量隨發(fā)酵時間的增加呈先上升后平穩(wěn)的趨勢，發(fā)酵第12天，發(fā)酵干芥菜的揮發(fā)酯含量達(dá)到頂峰，除只接種戊糖片球菌的試驗組外，其他接種發(fā)酵的產(chǎn)品揮發(fā)酯含量顯著高于自然發(fā)酵組(P<0.05)；發(fā)酵12 d后，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌3種菌混合發(fā)酵組與植物乳桿菌、戊糖片球菌兩種菌混合發(fā)酵組的揮發(fā)酯含量顯著高于其他組(P<0.05)，且3種菌混合發(fā)酵的揮發(fā)酯含量最高，為1.79～1.99 g/kg。綜上，不同菌種對發(fā)酵干芥菜揮發(fā)酯含量有較大影響，其中3種菌混合發(fā)酵產(chǎn)品的揮發(fā)酯含量較高，風(fēng)味較好。

2.2.5 對感官評分的影響 由表4可知，自然發(fā)酵產(chǎn)品組織較松散，酸味較淡，感官評分最低，為(68.5±0.7)，接種發(fā)酵產(chǎn)品在質(zhì)地、香氣和滋味3方面都顯著優(yōu)于自然發(fā)酵產(chǎn)品(P<0.05)；3種菌混合發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵香氣濃郁，發(fā)酵液較透明，口味酸爽脆嫩，其感官評分顯著高于其他發(fā)酵組(P<0.05)。因此，后續(xù)對3種菌株混合進(jìn)行進(jìn)一步配比，以得到最佳的配比。

同一發(fā)酵天數(shù)字母不同表示不同樣品之間具有顯著性差異(P<0.05)

同一發(fā)酵天數(shù)字母不同表示不同樣品之間具有顯著性差異(P<0.05)

2.3 混合菌株配比優(yōu)化

2.3.1 對總酸含量的影響 由圖11可知，發(fā)酵12 d后，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為2∶2∶1時總酸含量最高(為1.00%～1.11%)，其次為2∶3∶2(總酸含量為1.01%～1.07%)；發(fā)酵第18天，3種菌株配比為2∶3∶2時的總酸含量最高，與其他組有顯著性差異(P<0.05)。綜上，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為2∶2∶1和2∶3∶2時的發(fā)酵產(chǎn)品總酸含量較高，產(chǎn)品品質(zhì)較好。

2.3.2 對亞硝酸鹽含量的影響 由圖12可知，各組亞硝酸鹽含量均較低，分別于第6天或第9天出現(xiàn)峰值，最高為1.17 mg/kg；腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為2∶3∶2時的亞硝酸鹽含量顯著低于其他組(P<0.05)，于發(fā)酵第18天穩(wěn)定于0.34 mg/kg；其次為2∶2∶1和3∶1∶2的，分別于發(fā)酵第18天穩(wěn)定于0.41，0.43 mg/kg，但兩者之間無顯著性差異(P>0.05)。綜上，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為2∶3∶2，2∶2∶1，3∶1∶2時的發(fā)酵產(chǎn)品亞硝酸鹽含量較低。

表4 發(fā)酵干芥菜的感官評分?

同一發(fā)酵天數(shù)字母不同表示不同樣品之間具有顯著性差異(P<0.05)

2.3.3 對氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖13可知，發(fā)酵12 d 后，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為2∶3∶2時的氨基酸態(tài)氮含量最高(為0.13%～0.16%)，其次為2∶1∶3的(0.13%～0.14%)，發(fā)酵18 d后，其氨基酸態(tài)氮含量顯著高于其他組(P<0.05)。綜上，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為2∶3∶2，2∶1∶3時的發(fā)酵產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量較高，產(chǎn)品鮮味較好。

2.3.4 對揮發(fā)酯含量的影響 由圖14可知，發(fā)酵12 d后，各組揮發(fā)酯含量均趨于穩(wěn)定，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為3∶2∶3，2∶3∶2，2∶2∶1的揮發(fā)酯含量顯著高于其他組(P<0.05)；其中混合菌株配比為3∶2∶3時的揮發(fā)酯含量最高(為2.22～2.51 g/kg)，其次為2∶3∶2和2∶2∶1的。說明腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為3∶2∶3，2∶3∶2，2∶2∶1時的發(fā)酵產(chǎn)品揮發(fā)酯含量較高，產(chǎn)品有發(fā)酵芥菜特有的風(fēng)味。

2.3.5 對感官評分的影響 由表5可知，第6組產(chǎn)品的感官評分最高，其次是第8組，通過顯著性分析可知，這兩組產(chǎn)品之間的感官評分差異顯著(P<0.05)；各組產(chǎn)品在色澤評分上差異不顯著(P>0.05)，第6組和第8組在質(zhì)地評分和香氣評分上顯著優(yōu)于其他組(P<0.05)，第6組在滋味評分上優(yōu)于其他組(P<0.05)。綜上，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌配比為2∶3∶2，3∶2∶3時的發(fā)酵產(chǎn)品感官評分較高，酸度適中，發(fā)酵香氣較濃，風(fēng)味較好。

同一發(fā)酵天數(shù)字母不同表示不同樣品之間具有顯著性差異(P<0.05)

同一發(fā)酵天數(shù)字母不同表示不同樣品之間具有顯著性差異(P<0.05)

同一發(fā)酵天數(shù)字母不同表示不同樣品之間具有顯著性差異(P<0.05)

表5 混菌配比對發(fā)酵干芥菜感官評分的影響?

3 結(jié)論

以干芥菜作為原料，從腸膜明串珠菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌3株乳酸菌種中篩選發(fā)酵劑，分析了3種菌的發(fā)酵特性。結(jié)果表明：3株菌均可作為干芥菜的發(fā)酵菌株，3種菌株混合接種發(fā)酵的干芥菜產(chǎn)品總酸、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)酯含量和感官評分最高，亞硝酸鹽含量最低。其中腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌∶戊糖片球菌=2∶3∶2時，發(fā)酵干芥菜的總酸含量為1.07%，氨基酸態(tài)氮含量為0.16%，揮發(fā)酯含量為2.48 g/kg，感官評分為91.0，其品質(zhì)較高。研究探討了以干芥菜為原料生產(chǎn)發(fā)酵芥菜的可能性，通過人工接種乳酸菌提升產(chǎn)品品質(zhì)，縮短發(fā)酵周期。但使用的芥菜原料和菌種種類有限，下一步將研究不同原料品種和不同菌種對產(chǎn)品品質(zhì)的影響、發(fā)酵成品殺菌方式的優(yōu)化等。