產β-葡萄糖苷酶洋蟲內共生真菌篩選、鑒定及聯合轉化人參皂苷作用機制

房 柳 王艷成 董微巍 姬文秀

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133000)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)，素有“百草之王”之美稱，是中國中醫藥寶庫中的瑰寶，也是吉林省得天獨厚的特產資源，目前已有3 000多年的應用歷史[1]。由于人參具有免疫調節、抗癌、抗氧化、治療糖尿病和抗炎等藥理活性[2-6]。經過多年來的產業培育，人參開始走出中藥柜，被作為主要活性成分添加到食品、保健品之中，用來提高其產品功能性。人參皂苷是人參的主要活性成分，主要包括Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2和Rd等人參主皂苷和一些含量甚微的Rg3、compound K、Rh1、Rh2、Rh3等稀有人參皂苷，不同種類的人參皂苷具有不同的藥理活性。研究[7]表明，人參皂苷經水解(脫糖基)作用脫去糖基，轉化為稀有人參皂苷，稀有人參皂苷所含糖基少，生物利用度和藥理活性高。孫廣仁等[8]開發了一種多菌種發酵人參酒，人參酒發酵產生稀有皂苷提高了其功能性，改善了人參酒風味。蔡爽[9]開發了一種人參術苓酵素，發酵使人參皂苷轉化，具有緩解非潰瘍性消化不良的功效。篩選有利于人參發酵、高效轉化人參皂苷的功能菌株，提高人參產品功能性，體外合成稀有人參皂苷已成為國內外學者們所關注的焦點[10-12]。

昆蟲體內共生菌生存環境獨特，積累著大量具有特殊生理活性和功能的物質，也是人們發現微生物新物種和制備較好生物活性代謝產物的重要來源。目前多利用昆蟲共生菌中纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等分解纖維素、木質素、制備生物農藥等研究[13]，對開發利用昆蟲共生功能菌改性中草藥活性的研究報道很少。利用昆蟲內生菌資源發酵改性中草藥提高其功能與活性，為中草藥及其功能產品發酵提供微生物資源目前已日益被關注。Wang等[14]利用冬蟲夏草中真菌高效轉化人參皂苷Rb1→Rd→F2→compound K，轉化率高達82%，制得compound K純度高達91%。冬蟲夏草是中國青藏高原特有的名貴藥材，其資源稀少，價格昂貴，限制了它的廣泛使用[15]。藥用昆蟲洋蟲(Martianusdermestoides)主要以中藥人參、茯苓、紅花等為食，根據其習性推測洋蟲體內具有降解人參皂苷功能菌株。前期課題組成員[16]對洋蟲幼蟲和成蟲內生菌組成結構進行了系統分析，結果表明，洋蟲內不可培養的和未被分類的菌種占一定的比例，洋蟲體內共生菌是龐大的動態微生物寄居場所，是有待開發的生物資源。試驗擬利用動物藥洋蟲內特殊生境的微生物進行產β-葡萄糖苷酶功能菌株篩選、鑒定，并與植物藥人參中全組分人參皂苷發酵反應制備人參稀有皂苷(Rg3、Rh1和compound K)，以期改善人參生物利用度。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

洋蟲：延邊大學植物保護實驗室；

鮮人參根(4年生植物)：吉林集安；

正丁醇、甲醇、無水乙醇等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

PCR相關試劑：美國Genview公司；

色譜級乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和去離子水：色譜級，美國費希爾科學世界公司；

人參皂苷標準品(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh1、Rg2、Rg3、F1和compound K)：國家標準物質網；

真菌DNA提取試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

PCR擴增儀：2720-Thermal-Cycler型，美國應用生物系統公司；

高效液相色譜儀：Aglient1260LC型，安捷倫科技有限公司；

電子天平：YP600型，天津天馬橫基儀器有限公司；

離心沉淀器：80-2型，天津賽得利斯實驗儀器分析制造廠；

旋轉蒸發儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

恒溫水浴鍋：HH-S8A型，上海儀器儀表科技有限公司。

1.2 人參皂苷提取物

取新鮮人參根(4年生植物)樣品干燥并粉碎，取10 g粉末在82 ℃下用1 000 mL 80%乙醇回流冷凝2 h，反復兩次，合并萃取液，減壓濃縮后在50 ℃的烘箱中烘干，制備人參皂苷粗提物[17]。

1.3 洋蟲內共生菌液制備

1.3.1 洋蟲的飼養與馴化 按照80%紅棗和20%人參的比例混合飼料飼養馴化洋蟲，在30 cm×20 cm×10 cm培養箱中保持(24±2) ℃的溫度，培養1年。每批幼蟲培養15 d左右，裝入昆蟲培養箱，保持幼蟲和成蟲的適當密度，便于連續取食，保持種群的穩定。

1.3.2 洋蟲內共生菌液制備 取洋蟲成蟲15只，置于75%乙醇中90 s，用無菌水反復沖洗，在無菌操作臺用研缽研磨，加極少量蒸餾水移至離心管；先以500 r/min離心5 min，取出上清液，再以10 000 r/min離心5 min，取下方沉淀，加入生理鹽水制備洋蟲內共生菌菌液。

1.4 產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

1.4.1 產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選 利用10倍稀釋法逐級稀釋菌液，然后取100 μL洋蟲菌液加到MRS篩選培養基(加入七葉苷、檸檬酸鐵)上，采用涂布平板法將菌液在培養基上涂布均勻，密封，厭氧條件下恒溫培養箱中倒置培養72 h，觀察其生長狀況。挑選菌落呈黑色且邊緣整齊的單一菌落，利用劃線法將其接種到新的培養基上，多次重復直至得到單一菌株。從中挑選兩株生長狀態良好且菌落顏色較深的菌株進行后續試驗[18]。

1.4.2 產β-葡萄糖苷酶功能菌株的鑒定 DP336 試劑盒提取基因組DNA，序列通用引物(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’)進行PCR 擴增，PCR產物的測序工作由北京百邁客有限公司完成。

1.5 菌液與人參皂苷提取物發酵反應

取4 mg人參皂苷粗提物，加入500 μL菌液至2 mL離心管中，在85% N2、10% H2和5% CO2的厭氧條件下，將篩選出的菌株以及二者的混合菌株富集培養24 h，取人參主皂苷與菌液反應20 d，采用高效液相色譜質譜聯用儀(LC-MS/MS)對不同發酵時間(0，1，2，3，7，12，20 d)下的生物轉化產物進行研究。

1.6 LC-MS/MS分析產物

發酵產物經飽和正丁醇3倍體積萃取，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，反復3次；將萃取出的菌液旋轉蒸發至膏狀，加入100 μL液相甲醇，移至液相小瓶，LC-MS/MS分析。安捷倫1260系列液相色譜系統與安捷倫Poroshell ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和C18保護柱對其進行檢測分析。該系統使用Mass Hunter采集軟件B.07.00進行操作。流動相由水(0.1%甲酸，溶劑A)和乙腈(0.1%甲酸，溶劑B)組成，采用以下梯度洗脫程序：0～13 min，0%～23% B；13～33 min，23%～46% B；33～38 min，46%～68% B；38～45 min，68%～68% B；45～55 min，68%～100% B。進樣量2 μL，流速0.5 mL/min，檢測波長203 nm。

利用安捷倫6420型三重四極質譜儀(QQQ-MS)對化合物進行質譜分析。采用正電噴霧離子化(ESI)MS-MS對人參皂苷的代謝產物進行分析。毛細管電壓為4 000 V，氣體以3 L/min的速度流動，氣體溫度為300 ℃。獲得了m/z500～1 500質量范圍內的全掃描質譜圖。通過測定發酵產物中[M+Na]+或[M-2H2O+OH]+離子片段質量來確定人參皂苷含量。

1.7 方法驗證

定量分析采用外標法。制備含有12種人參皂苷標準物質溶液，并稀釋至適當濃度，以繪制標準曲線。通過繪制峰面積與各分析物濃度之間的關系，得到校正曲線。在色譜條件下，以信噪比S/N=3為檢測限(LOD)、S/N=10為定量限(LOQ)為原則，計算12個目標分析物的檢測限和定量限。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

利用七葉苷顯色原理，即七葉苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成的6,7-二羥香豆素也叫七葉苷元，與鐵離子反應，使培養基內的菌落周圍生成黑褐色物質，從洋蟲成蟲10個菌液樣品體內篩選出2株具有產生β-葡萄糖苷酶的功能真菌，編號為WY1、WY2，經18S rRNA基因擴增分別對兩株產β-葡萄糖苷酶真菌進行鑒定。洋蟲內生真菌WY1經PCR擴增后獲得1條558 bp左右的特異性條帶，WY2經PCR擴增后獲得1條598 bp左右的特異性條帶，將序列提交至NCBI數據庫，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過軟件CLUSTALX 1.83和MEGA 7.00構建系統發育樹(見圖1)。

通過系統發育樹分析結果表明，WY1序列與菌株Chaetomiumglobosum相似度達98%，定性該菌株為Chaetomium屬，WY2序列與菌株Aspergillusfumigatus相似度達93%，初步定性該菌株為Aspergillus屬。

2.2 菌株與人參皂苷發酵反應

2.2.1 定量方法驗證 對一定濃度范圍內的人參皂苷標椎品線性校準曲線進行分析，并進行線性回歸計算，按3倍信噪比和10倍信噪比計算方法分別確定檢出限和定量限，參數與結果見表1。

如表1所示，在質量濃度50～5 000 ng/mL范圍內，相關系數均大于0.992，所有分析物的濃度與峰面積呈良好的線性關系，可以滿足12種人參皂苷標準化合物檢測計算要求。

2.2.2 內生菌WY1與人參皂苷提取液發酵產物分析

利用內生菌WY1對人參皂苷提取液進行生物轉化，通過HPLC-MS/MS對發酵產物中人參皂苷進行定性分析，檢測結果如圖2所示。

由圖2可知，在人參粗提掖中共有7種人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd)在WY1作用下，發酵產物為稀有人參皂苷Rh1。

定量分析了人參主皂苷在WY1菌液作用下動態發酵過程發酵產物中人參皂苷的變化趨勢，如圖3所示。人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著與WY1菌液的發酵反應時間增長而逐漸減少，而人參主皂苷Rd含量呈先減少后升高的變化趨勢。代謝初期Rd 被水解轉化，在0～5 d其含量隨著時間變化而逐漸減少，但是，由于二醇類人參皂苷Rb1、Rc、Rb2在發酵反應過程中水解掉C-20位外部糖基轉化被轉化生成Rd，在5～20 d 其含量又呈升高趨勢，所以在WY1作用下轉化途徑是Rb1/Rb2/Rc→Rd。稀有人參皂苷Rh1是三醇類人參皂苷(Rg1，Re，Rf)主要發酵產物，其可能由于在WY1作用下人參皂苷Re水解掉C-6位外部糖基轉化為人參皂苷Rg1，人參皂苷Rg1水解掉C-6位外部糖基轉化為人參皂苷Rh1；Rf水解掉C-6位外部糖基直接轉化為Rh1，其轉化途徑為Re→Rg1→Rh1；Rf→Rh1，為此，隨著發酵反應進行人參皂苷Rh1含量逐漸升高。目前，稀有人參皂苷Rh1主要是通過合成和轉化的方法來獲取，其中微生物轉化法具有反應體系穩定、菌種生長迅速且無需分離純化酶液等優點，受到眾多研究者的青睞[19]，試驗從洋蟲內分離的C. WY1可以與人參總皂苷發生去糖基化反應，將人參皂苷中二醇類皂苷轉化為Rd，將三醇類皂苷生物轉化為稀有皂苷Rh1，可為制備靶向制備Rh1發酵功能菌提供資源。

圖1 菌株的系統發育樹

2.2.3 內生菌WY2與人參皂苷提取液發酵產物分析

利用HPLC-MS/MS定性分析內生菌WY2對人參皂苷提取液發酵產物中的人參皂苷，發酵反應總離子色譜圖如圖4所示。

由圖4可知，在人參粗提液中共有7種人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd)在WY2作用下，發酵產物為稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K。定量分析了人參主皂苷在WY2菌液作用下動態發酵過程發酵產物中人參皂苷的變化趨勢，如圖5所示。

表1 12種人參皂苷的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢測限和定量限

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖3 發酵過程中7種人參主皂苷含量及其轉化產物Rh1隨時間變化曲線

WY2菌液發酵人參皂苷(0，1，3，5，7，10，20 d)動態反應中，人參主皂苷濃度—時間曲線如圖5(a)所示，人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著與WY2菌液的發酵反應時間增長而逐漸減少，發酵第3天產生稀有人參皂苷Rg3和compound K，其主要由于人參皂苷(Rb1、Rb2、Rc)水解掉C-20位外部糖基轉化為人參皂苷Rd，Rd作為中間代謝產物水解掉C-20位糖基轉化為人參皂苷Rg3，水解掉C-3位糖基轉化為compound K，其轉化途徑為Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K，所以人參主皂苷Rd含量呈先減少后升高，Rg3和compound K含量隨著發酵反應時間增長而增加的變化趨勢。同2.3.1人參皂苷Rh1是三醇類皂苷Rg1、Re和Rf的主要轉化產物，隨著發酵反應進行含量逐漸升高。

煙曲霉WY2屬曲霉菌屬，目前在微生物轉化領域具有一定的應用前景，如馬宗敏等[20]采用黑曲霉對薯蕷科植物黃山藥根莖進行微生物轉化，轉化后得到了4個化合物，左明星等[21]利用煙曲霉GZWMJZ-152將茶粕中的山茶苷代謝，從發酵提取物中分離得到5個化合物，其曲霉菌屬在發酵中草藥植物中已具有較高的研究價值。試驗利用洋蟲內分離的煙曲霉WY2轉化人參皂苷萃取液新增了3種活性皂苷化合物。

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖5 WY2發酵7種人參主皂苷中發酵產物皂苷含量隨時間變化曲線

2.2.4 內生菌WY1/WY2聯合發酵人參皂苷提取液產物分析 利用HPLC-MS/MS定性分析內生菌WY1/WY2兩菌按1∶1比例復合發酵人參皂苷，提取液產物中的人參皂苷，發酵反應總離子色譜圖如圖6所示。

由圖6可知，人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2在聯合菌劑作用下代謝轉化的稀有人參皂苷分別為Rh1、Rg3和compound K。WY1/WY2聯合菌劑發酵人參皂苷在(0，1，3，5，7，10，20 d)動態反應中定量分析了兩株菌株聯合發酵轉化人參皂苷的反應產物，人參皂苷成分隨時間變化曲線如圖7所示。

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

圖7 WY1/WY2發酵7種人參主皂苷中發酵產物中皂苷含量隨時間變化曲線

由圖7(a)可知，人參主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量隨著發酵反應時間增長逐漸減少，人參皂苷Rd因在WY1/WY2作用下發生水解反應，發酵初期因被水解而呈減少趨勢，但由于二醇類主皂苷(Rb1、Rc和Rb2)在發酵過程中產生了人參皂苷Rd，其含量在3 d后開始出現逐漸升高趨勢。三醇類皂苷反應產物稀有人參皂苷Rh1在發酵第1天開始產生，隨著發酵反應進行含量逐漸升高，在發酵第3天產生稀有人參皂苷Rg3和compound K，其含量隨著發酵反應時間增長而增加，轉化機制同2.3.2所述。

微生物在生長發酵過程中會產生很多酶，具有強大的代謝能力，可以提高中藥的有效成分含量。WY1/WY2雙菌聯合發酵，可改善人參皂苷生物活性，與單一菌株相比可提高稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K的轉化效率。相關的研究[22]以及生產實踐表明，使用多種菌株進行混合發酵制備的相關產品，與單一菌種發酵相比，具有更好的品質與效果，在試驗的兩種菌株作用下人參二醇類皂苷比人參三醇類皂苷更容易被轉化，二醇類主皂苷大部分被轉化為稀有人參皂苷Rg3。

3 結論

篩選出兩株洋蟲體內共生產β-葡萄糖苷酶真菌ChaetomiumglobosumWY1和AspergillusfumigatusWY2及WY1/WY2聯合菌劑分別與全組分人參皂苷發酵培養，通過比較WY1/WY2聯合菌劑轉化制備稀有人參皂苷Rh1、Rg3和compound K較為高效，轉化途徑為Re→Rg1→Rh1；Rf→Rh1；Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K。為了更好地提高人參皂苷的轉化效率，該研究將繼續對WY1/ WY2聯合菌劑的培養條件pH、溫度、培養基等進行優化。