多抗轉基因馬鈴薯植株的獲得及農桿菌介導試管薯遺傳轉化體系優化

齊恩芳 賈小霞 劉石 陳曉艷 黃偉 劉世海

摘要：以馬鈴薯品種隴薯11號試管薯為受體材料，通過農桿菌介導法，將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒CP融合基因導入馬鈴薯，并對影響遺傳轉化的因素進行了優化。結果表明，薯片分化和生根階段的選擇壓分別為Kan 50、75 mg/L，薯片分化和生根階段有效抑菌濃度分別為Cb 500、200 mg/L，農桿菌活化時間為4.5 h、侵染時間為7 min、共培養時間為2 d時利于遺傳轉化。通過該體系將4種病毒CP融合基因導入馬鈴薯，獲得了具卡那霉素抗性的轉化植株，經PCR檢測，外源基因已導入馬鈴薯基因組中。

關鍵詞：馬鈴薯;試管薯;農桿菌介導;遺傳轉化

中圖分類號：S532? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2020）11-0001-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.11.001

Abstract：The CP fusion genes of PVX， PVS， PVY and PLRV were transferred into Longshu 11 test tube potato through the agrobacterium-mediated method， and condtions of which was also optimized. The results showed the optimal Kan selective concentration is 50 mg/L and 75 mg/L for potato chip differentiation and root germination respectively， and Cb is 500 mg/L and 200 mg/L. The optimal transformation conditions： agrobacterium should be actived for 4.5 hours， transfection for 7 minutes， and co-cultivation time for 2 days， it was beneficial to genetic transformation. Via this system， four viral CP fusion gene were introduced into potatoes， and later transformed plants with kanamycin resistance were obtained. PCR detection confirmed the fusion gene had been successfully introduced into those potato genome.

Key words：Potato;Tube potato;Agrobacterium mediated;Genetic transformation

馬鈴薯是一種產量高、適應性強、分布廣、營養豐富、經濟價值高的宜糧、宜菜、宜飼、宜作工業原料的經濟作物[1 - 2 ]。馬鈴薯在生長期間易受多種病毒的危害，病毒侵染造成馬鈴薯種質退化，產量嚴重降低。迄今為止，幾乎沒有有效的化學藥劑來防治病毒病，目前解決馬鈴薯退化的有效途徑是組培脫毒，但該法成本高且工作量大，不能解決病毒的再侵染問題，能維護無毒或低毒的有效期不長，2～3 a后產量又會嚴重下降。馬鈴薯是同源四倍體作物，若采用常規方法選育抗病毒品種，則存在天然抗性基因資源缺乏，且育種周期長、抗性基因的遺傳不穩定以及遠緣雜交種間障礙等問題。馬鈴薯抗病毒基因工程的發展解決了這一難題，通過基因工程改良馬鈴薯品種具有基因明確、產物已知、目標具體、準確快速、可預見性強等優勢，且馬鈴薯是無性繁殖植物，轉基因植株無性后代不發生分離，給轉基因植株的檢測、鑒定帶來諸多方便。

建立高效的遺傳轉化體系對于獲得轉基因植株至關重要。在馬鈴薯遺傳轉化中以葉片、莖段、薯片作為受體已廣泛應用，其中試管薯片作為受體材料傷口面積大，且薯塊本身含有較高含量的酚類物質，有助于農桿菌的侵染和轉化[3 - 5 ]，不經愈傷化可直接誘導芽再生。薯片轉化過程中不需要預培養，操作簡單方便，周期短，但針對不同基因型轉化的適宜條件有一定差異。我們以馬鈴薯品種隴薯11號脫毒試管苗為材料，采用農桿菌菌株LBA4404為介導，將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒外殼蛋白融合基因導入馬鈴薯，并通過對選擇壓、抗菌素濃度、農桿菌菌液濃度、侵染時間、共培養時間等因素進行選擇，建立了一套優化的高效轉化體系。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

供試材料為馬鈴薯品種隴薯11號脫毒苗，由甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所種質資源與生物技術研究室提供。供試菌株LBA4404含有質粒pART27-XSYV-rh（甘肅省馬鈴薯種質資源創新工程實驗室構建）[6 ]，pART27- XSYV-rh含4 種病毒（PVX、PVS、PVY 和 PLRV）CP基因片段，抗性標記為卡拉霉素（Kan）。DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。培養基基礎成分、植物激素、抗生素、添加劑均購自美國Sigma 公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2? ?培養基

YEP液體培養基為10 g/L酵母提取物+ 10 g/L蛋白胨+5 g/L牛肉膏。試管薯誘導培養基為MS培養基+6-芐氨基嘌呤（6-BA）5 mg/L。試管薯片分化培養基為MS培養基+吲哚乙酸（IAA）1.0 mg/L+赤霉素（GA3）0.2 mg/L+6-芐氨基嘌呤（6-BA）0.5 mg/L+玉米素核苷（ZT）2.0 mg/L。生根培養基為1/2 MS培養基。

1.3? ?轉化外植體的獲得

將隴薯11號試管苗在MS固體培養基上培養21 d，長成壯苗后用于誘導試管薯。參照“固體+液體”的方法誘導試管苗結薯[7 ]。

1.4? ?遺傳轉化體系優化

1.4.1? ? 誘導芽與生根選擇壓確定? ? 無菌條件下取直徑約為0.5 cm的隴薯11號試管薯，切成厚度為2 mm左右的薄片，分別接種于附加0、25、50、75、100 mg/L 卡拉霉素（Kanamycin，Kan）的試管薯片分化培養基中，每處理接種20塊，3次重復，間隔14 d繼代1次，接種28 d后觀察薯片生長情況并統計出芽率，確定抑制芽分化的最低Kan濃度。將隴薯11號試管苗剪成帶2個腋芽的莖段，分別接到含Kan濃度0、25、50、75、100 mg/L的生根培養基中，3個重復，21 d后觀察并記錄生根狀況，確定抑制生根最適Kan濃度。

1.4.2? ? 農桿菌工程菌生長曲線? ? 挑取農桿菌菌種，接種于含Kan 50 mg/L、鏈霉素（Streptomycin，Str）50 mg/L和利福平（Rifampicin，Rif）20 mg/L的YEP平板上，置28 ℃暗培養，2 d后挑取單菌落放入5 mL含有同樣抗生素的YEP液體培養基中，于28 ℃、260 rpm條件下避光振蕩培養約24～36 h。將活化好的菌液按1∶50放大培養（即取1 mL活化好的菌液加入到50 mL含Kan 50 mg/L、Str 50 mg/L、Rif 20 mg/L的YEP液體培養基中，再置于28 ℃恒溫搖床，260 rpm條件下避光振蕩培養），分別設1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 h共13個時間梯度，每個時間段各取2 mL菌液，在波長600 nm下用分光光度計測定其紫外吸收值OD600，每處理3次重復，用未加菌液的YEP液體培養基調零，計算3次重復樣品的OD600平均值，最終確定農桿菌達到對數生長期所需的搖菌時間（即OD600=0.5左右的臨界點）。

1.4.3? ? 侵染時間? ? 用OD600=0.5的農桿菌菌液侵染薯片，侵染時間設為3、5、7、9、11、13、15 min，接種于試管薯片分化培養基上，每個培養皿20塊，每處理3次重復，20 d后統計薯塊出芽率、污染率及褐化率。

出芽率=（出抗性芽薯塊數/接種薯塊總數）×100%

污染率=（污染的薯塊數/接種薯塊總數）×100%

褐化率=（褐化的薯塊數/接種薯塊總數）×100%

1.4.4? ? 共培養時間? ? 選擇侵染7 min的處理置于28 ℃、黑暗條件下共培養，共培養時間設為1、2、3、4 d，30 d后觀察薯塊生長狀態，統計出芽率。

1.4.5? ? 抑菌劑濃度? ? 將共培養后的薯塊分別轉接到附加羧芐青霉素（Carbenicillin，Cb）100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的試管薯片分化培養基中，光照時間為14 h/d，培養溫度為（25±2） ℃，7 d后觀察農桿菌溢出情況。將分化出的芽分別轉接到附加Cb 100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的生根培養基中，7 d后觀察農桿菌溢出情況。

1.5? ?轉基因植株鑒定

采用CTAB法提取待檢測植株和對照植株葉片總DNA，參照賈小霞等[8 ]的方法對轉基因馬鈴薯植株進行PCR鑒定。以非轉基因馬鈴薯植株為陰性對照，pART27- XSYV-rh質粒為陽性對照。反應程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循環35次，72 ℃ 10 min。取5 uL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分離并觀察擴增產物。

2? ?結果與分析

2.1? ?Kan濃度對試管薯片芽分化及生根的影響

觀察發現，試管薯片在芽分化培養基上培養14～21 d后，不加Kan的薯片直接分化長出綠色健壯小芽。Kan濃度為25 mg/L時，薯片增厚、變大、顏色鮮綠，分化出芽情況與不加Kan無明顯差異;Kan濃度為50 mg/L時，薯片稍有膨大，顏色暗綠，不能分化出芽;Kan濃度為75 mg/L時，部分薯片膨大，顏色發暗，褐化嚴重;Kan濃度為100 mg/L時，薯片全部褐化死亡。因此確定芽誘導時Kan濃度為50 mg/L。

在抗性芽生根階段仍需要加入Kan，以防止產生大量假陽性植株。接種28 d后，不加Kan的植株生長旺盛，根系發達，而加入Kan的處理雖然也有植株生長，但是隨著Kan濃度的增加生根受限。Kan濃度為25 mg/L時，植株生根正常;Kan濃度為50 mg/L時，能正常生根，但植株生長緩慢;Kan濃度為75 mg/L時，部分植株生根，葉片發黃;Kan濃度為100 mg/L時，幾乎沒有根系，葉片全部發黃。因此確定生根時 Kan濃度為75 mg/L。

2.2? ?農桿菌工程菌活化時間確定

農桿菌液活化時間對于遺傳轉化的效果至關重要，活化時間短，菌液濃度過低，不利于侵染，轉化率較低，菌液濃度過高，容易使薯片傷口褐化死亡。從含有質粒pART27-XSYV-rh的農桿菌LBA4404- pART27- XSYV- rh的生長曲線測定結果（表1）。可以看出，活化培養時間為4.5 h左右時農桿菌生長最快。

2.3? ?侵染時間對轉化的影響

侵染時間影響轉化效率，時間太短不利于農桿菌的附著，時間過長，容易導致菌的滋生，溢出的菌液會過多而無法控制，下一步除菌時不容易清除干凈，易導致薯片褐化死亡。通過表2可以看出，侵染時間為7 min時出芽率達到50.0%，褐化率、污染率相對較低，因此選擇侵染7 min為轉化條件。

2.4? ?共培養時間對轉化的影響

共培養時間對薯塊誘導出芽有很大影響，隨著共培養時間的延長，污染加重，出芽率下降。可能是因為農桿菌與外植體共培養的時間過長，農桿菌過度繁殖使其生長速率遠遠超過外植體細胞的分裂分化能力，致使外植體發生重度感染而出現軟腐現象，最終失去再生愈傷能力。通過表3可以看出，試管薯塊最佳共培養時間為2 d時最佳，出芽率達到75.0%，污染率為10.0%。

2.5? ?Cb對轉化的影響

抗性愈傷篩選過程中需要及時去除農桿菌，否則整個外植體將會腐爛致死，無法再生，嚴重影響轉化。為了抑制和殺死農桿菌菌株，需要在抗性愈傷篩選過程中加入一定濃度的抗生素。不同抗生素對農桿菌的抑制效果不同，同種抗生素不同濃度對農桿菌的抑制效果也不同。在芽分化和生根階段加入不同濃度Cb的結果（表4）表明，當Cb濃度為500 mg/L時，才能有效抑制薯塊芽分化階段的農桿菌溢出，植株生長表面無不良反應，生長變慢，但基本上不影響出芽;而在生根階段，Cb濃度為200 mg/L時就能很好地抑制農桿菌的溢出，不影響植株生長。

2.6? ?轉基因植株的PCR檢測

試管薯薄片分化出芽后（圖1A），待抗性芽長至1～2 cm時剪下接入附加有Kan 75 mg/L 和Cb 200 mg/L 的生根培養基上培養，14 d后生根生長則繼續轉接，經3次相同濃度Kan抗性生根篩選后，獲得正常生長的20株抗性植株（圖1B）。PCR擴增產物的電泳分析結果（圖2）表明，6株抗性苗DNA能擴增出分子量約為1 200 bp左右的特異性目的片段，而非轉化植株未擴增出相應條帶，初步證明這6株再生植株為轉基因植株。

3? ?小結與討論

農桿菌介導馬鈴薯遺傳轉化方法已廣泛應用，但針對不同的基因型、不同的外植體，轉化效果差異仍很大，要根據具體基因型和外植體進行優化選擇。作為遺傳轉化的受體材料，必須具備來源充足、再生頻率高、再生穩定、遺傳穩定性好、培養時間短和對標記選擇性抗生素敏感等特點[9 ]。在馬鈴薯的遺傳轉化體系中，以莖段、葉片、塊莖和試管薯為受體的Ti質粒轉化均已獲得成功。李晶等[10 ]對馬鈴薯再生培養基、基因型、外植體類型進行了系統篩選，將幾丁質酶（chi）基因成功導入馬鈴薯東農303;邢小萍[11 ]以葉盤、莖段、葉柄為外植體，將抗菌肽基因導入馬鈴薯甘農薯 1號，并對影響轉化效率的主要條件進行了篩選;尤佳 等[12 ]用馬鈴薯栽培品種隴薯3號和甘農薯2號試管薯為外植體，獲得了轉基因植株;李珺等[13 ]用蠟質馬鈴薯突變植株的莖段作為外植體，獲得了轉基因植株，其轉化率約為34%。本試驗以馬鈴薯品種“隴薯11號”試管薯為外植體，通過根癌農桿菌介導的方法成功轉化馬鈴薯，并對遺傳轉化體系中關鍵因素進行了優化。

在植物轉化過程中，既能夠有效地去除農桿菌侵染所造成的污染又要不影響植株正常生長，同時又能夠有效選擇出轉基因陽性植株。此過程涉及抗生素種類和濃度的正確選擇過程，該階段也是轉化試驗順利進行的一個前提條件。抑菌素種類的選用與農桿菌的類型有關，有研究表明Cb對多個農桿菌菌株都有較強的抑制作用[13 ]。本試驗選用Cb來抑制遺傳轉化過程中農桿菌的滋生，在芽分化和生根階段分別用Cb 500 mg/L和200 mg/L來抑制農桿菌的生長，與張寧等[4 ]、尤佳等[12 ]的研究結果一致。因為本試驗選用的載體pBI121所含的選擇標記基因為新霉素磷酸轉移酶基因（npt-Ⅱ），該基因為Kan抗性基因，其轉化的組織或器官能在含有一定濃度的Kan培養基上生長，反之未被轉化的組織或器官將會死亡。試驗選用Kan 50 mg/L 作為芽分化階段的篩選壓力，選用Kan 75 mg/L作為生根階段篩選壓力。侵染和共培養時間在遺傳轉化中舉足輕重，侵染時間太短，共培養時無農桿菌生長，轉化失敗;侵染時間太長，常因農桿菌毒害缺氧而軟腐，確定農桿菌活化時間為4.5 h，薯塊侵染時間為7 min，有助于減輕后續培養中細菌對植物的毒害作用，提高轉化效率。共培養過程是為了使農桿菌能夠很好地在外植體上附著，在恰當的時間將質粒T-DNA轉移到外植體的細胞中，從而完成轉化過程。最佳共培養時間的確定是為了使農桿菌附著外植體表面后有足夠的時間在創傷部位誘發腫瘤，因此共培養時間不能太短;若共培養時間過長則會由于農桿菌的過度生長而使外植體受到毒害死亡，即便不死亡也會在后續培養中難以控制。本試驗確定共培養時間為2 d，此時外植體周圍剛出現白色菌落，選擇這個時間既能提高轉化效率，又易去除農桿菌。

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（本文責編：陳? ? 偉）