CRSwNP患者YKL-40、TLR4基因表達及嗜酸性粒細胞水平與復發的相關性

董春花 張英 岳光浩

慢性鼻-鼻竇炎（chonic sinusitis，CRS）是發生在鼻-鼻竇的持續12 周以上的慢性炎性反應，有較高的發病率。該癥主癥為鼻塞或黏膿涕，次要癥狀為頭部、臉面部脹痛及嗅覺障礙，此外在鼻內鏡檢查中還可見中鼻道、嗅裂有分泌物，鼻粘膜呈充血、水腫狀態或出現息肉［1］。CRS 伴鼻息肉（chonic sinusitis with nasalpolyp，CRSwNP）是CRS的亞型之一，感染、免疫、鼻腔結構異常、鼻粘膜功能異常及基因遺傳等均是該癥發生的基本病因。由于該癥有一定復發性，對參與預后及復發的相關指標進行觀察于臨床治療有重要意義。CRSwNP的組織學類型主要有嗜酸性粒細胞（eosinophi，EOS）型及非EOS 型，EOS 是鼻息肉的重要致病物質，可參與炎癥的發展過程［2］。幾丁質酶3 樣蛋白1（chitinase-3-like protein 1，YKL-40）是人類組織中最多見的糖蛋白，研究表明其為炎癥標志物之一，在眾多疾病的發生中起著關鍵作用［3］。Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）作為Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，可誘導核因子活化B 細胞κ 輕鏈增強子（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路的激活，進而促進炎癥反應［4］。本研究就CRS 伴鼻息肉患者YKL-40、TLR4 及EOS 的變化與其預后復發的相關性進行研究，探討其在CRSwNP 患者發生和發展中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月至2019年1月本院收治的159 例CRS 患者資料，按是否伴息肉分為伴息肉組（n=84）、不伴息肉組（n=75），納入標準：均滿足《中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南（2018）》診斷標準［5］者；臨床資料完整；排除標準：入組前1月內接受糖皮質激素類藥物、抗菌藥物治療者，存在腫瘤、免疫系統疾病、其他呼吸道疾病及高血壓、糖尿病、冠心病、高血脂等基礎疾病者。選取同期本院收治的71 例單純外傷性鼻中隔偏曲患者作為對照組，3 組性別、年齡、體重、吸煙史等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 3 組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data of the 3 groups（±s）

表1 3 組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data of the 3 groups（±s）

組別伴息肉組不伴息肉組對照組F/χ2值P 值n 84 75 71性別（男/女）45/39 42/33 40/31 0.147 0.929年齡46.13±5.33 45.79±5.48 46.21±5.31 0.13 0.880 BMI（kg/）21.79±1.35 21.85±1.27 21.66±1.29 0.40 0.669吸煙史46 43 41 0.169 0.919

1.2 方法

1.2.1 研究方法

收集所有研究對象臨床及隨訪資料，記錄所有患者YKL-40、TLR4、NF-κB、EOS 水平及CRSwNP 患者預后復發情況，采用多元Logistic 分析影響復發的危險因素。

1.2.2 YKL-40、TLR4 及EOS 水平檢測方法

采集所有研究對象鼻竇粘膜，使用生理鹽水清洗表面后保存在10%甲醛溶液中并置于-80℃恒溫箱，分為三份。YKL-40、TLR4、NF-κB 檢測：3 組留取標本經生理鹽水沖洗后保存于-70℃冰箱中備檢。檢測方法采用熒光染料法反轉錄實時熒光定量PCR：取出凍存的組織，采用TRIZOL 總RNA 提取試劑盒（美國Invitorgen 公司）提取總RNA，按試逆轉錄試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司）將總RNA 逆轉錄，得到cDNA，以cDNA 為模板用PCR 試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）進行檢測。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，其中，YKL-40 引物序列上游：5′-TGAG-GCATCGCAATGTAAG-3′ ，下游：5′-AAGGGGAAG-TAGGATAGGGG-3′；TLR4 引物序列上游：5′-TGTC-CTCCCACTCCAGGTAAGT-3′，下游：5′-GATTGCT-CAGACCTGGCAGTT-3′；NFκB 序列上游：5′-TCCAGAAGTATTTCAACCACAG-3′，下游：5′-GCCT-TCACATACATAACGGA-3′。PCR 反應條件：連續反應38 個循環，分別是90℃60 s；92℃30 s；56℃30 s；74℃30 s。每個標品均設3 個平行反應復孔，參照每孔Ct 值進行分析。外周血EOS 來自入組時血常規檢測。

1.2.3 隨訪及治療

所有伴鼻息肉患者均行內鏡下鼻竇術治療，自出院后開展隨訪（電話隨訪及面對面隨訪），隨訪時間截止2020年4月。隨訪中若患者癥狀未緩解，可給予激素治療。復發標準［5］：鼻塞、流涕、嗅覺障礙等癥狀評分；采用視覺模擬量表（VAS）［6］評價：0 分、0～3 分輕度、4～7 分重度、8～10 分重度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0 軟件進行統計分析，計量資料采用（±s）描述，兩組間用t檢驗，多組間用F檢驗；計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗；影響CRSwNP 患者復發的危險因素使用Logistic回歸分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組YKL-40、TLR4、NF-κB 表達情況、外周血及組織EOS 比例比較

伴息肉組YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 水平、外周血及組織EOS 比例較未伴息肉組和對照組高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3 組YKL-40、TLR4、NF-κB mRNA 水平及組織EOS 比例比較（±s）Table 2 Comparison of YKL-40，TLR4，NF-κB mRNA levels and tissue EOS proportion in the 3 groups（±s）

表2 3 組YKL-40、TLR4、NF-κB mRNA 水平及組織EOS 比例比較（±s）Table 2 Comparison of YKL-40，TLR4，NF-κB mRNA levels and tissue EOS proportion in the 3 groups（±s）

組別伴息肉組不伴息肉組對照組F 值P 值n 84 75 71 YKL-40 mRNA 0.97±0.31 0.71±0.25 0.49±0.13 73.67＜0.001 TLR4 mRNA 0.93±0.15 0.67±0.13 0.43±0.12 265.94＜0.001 NF-κB mRNA 0.89±0.13 0.65±0.11 0.31±0.05 595.57＜0.001組織EOS 比例（%）4.97±1.57 3.21±1.56 2.19±1.03 76.50＜0.001外周血EOS 計數（L-1，×109）0.31±0.12 0.14±0.05 0.07±0.01 196.26＜0.001

2.2 CRSwNP 患者復發情況

84 例伴息肉組患者截至隨訪前共有45 例復發，復發率為53.57%；按是否復發分為復發組（n=45）及非復發組（n=39）。

2.3 影響CRSwNP 患者復發的單因素分析

復發組和非復發組在年齡、性別、外周血淋巴細胞比例、流涕評分及鼻塞評分比較差異無統計學意義（P＞0.05），而復發組合并哮喘比例、嗅覺障礙評分、YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 水平及外周血、組織EOS 比例較非復發組高，組織淋巴細胞比例及組織漿細胞較復發組低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 影響CRSwNP 患者復發的多因素分析

高YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 表達量及組織EOS 增多是影響CRSwNP 患者復發的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4。

3 討論

CRSwNP 患者的臨床癥狀可隨鼻息肉體積的增大而加重，且常并發支氣管哮喘、分泌性中耳炎等癥狀，進而對呼吸系統造成一定影響，造成生活質量的降低。CRSwNP 的發病機制較為復雜，目前主要存在細菌生物膜、超抗原及變態反應三種假說。YKL-40 是一種分泌型糖蛋白，屬于18 糖基水解酶家族，近年的研究表明其可識別細胞外基質中的透明質酸，并可在炎癥反應的細胞增殖、分化及組織重塑等病理過程中發揮重要作用［7］。周凌等［8］研究顯示，血清YKL-40 與社區獲得性肺炎的發病有關。類似的，何作華等［9］研究發現重癥肺炎患者體內YKL-40 水平顯著升高，提示YKL-40與炎癥性疾病有密切關系。

表3 影響CRSwNP 患者復發的單因素分析（±s）Table 3 Single factor analysis of the influence on the recurrence of CRSwNP patients（±s）

類別性別年齡（歲）外周血淋巴細胞比例（%）鼻塞評分（分）流涕評分（分）合并哮喘（n）嗅覺障礙評分（分）YKL-40 mRNA TLR4 mRNA NF-κB mRNA組織EOS 比例（%）外周血EOS 計數（L-1，×109）男女復發組（n=45）23 22 47.33±5.11 35.86±5.31 7.45±1.05 5.89±2.13 13 4.95±1.03 1.13±0.51 1.19±0.23 1.31±0.65 5.23±1.57 0.55±0.13非復發組（n=39）15 14 47.51±5.27 34.89±5.36 7.37±1.13 5.21±2.01 3 1.24±0.86 0.85±0.43 0.91±0.15 0.89±0.51 4.55±1.39 0.29±0.11 t/χ2值0.003 0.159 0.831 0.336 1.498 6.088 17.757 2.697 6.496 3.258 2.087 9.810 P 值0.959 0.874 0.408 0.738 0.138 0.014 0.001 0.009 0.001 0.002 0.040 0.001

表4 影響CRSwNP 患者復發的多因素分析Table 4 Multivariate analysis of the influence of recurrence in crswnp patients

NF-κB 作為一種核轉錄因子，可參與炎癥反應、腫瘤生成和細胞凋亡，是機體免疫系統重要的組成部分［11］。TLR4 作為一種跨膜蛋白，其胞外大量的亮氨酸重復序列結構域對結合配體功能有重要意義［12］。近年來YKL-40、TLR4、NF-κB在CRSwNP 發病機制中的作用受到關注，本研究結果證實YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 水平變化可體現CRSwNP 發生和發展程度。

EOS 顆粒由于含有大量毒性產物，包括嗜酸細胞陽離子蛋白、白三烯、趨化因子等，可造成氣道解剖結構和功能的異常，導致多種呼吸道疾病的發生［13-14］。此外，EOS 活化后嗜酸細胞陽離子蛋白呈高表達狀態，可加速炎性浸潤［15］。本研究結果表明CRSwNP 患者鼻粘膜炎性浸潤嚴重。

相關研究指出CRSwNP 患者復發率可達50%～70%［16］，因此經手術治療后再次手術率較高。本研究結果基本與既往研究報道相似。進一步分析影響CRSwNP 患者復發的相關因素，馬越等［17］通過收集22 例CRSwNP 患者臨床資料，發現YKL 在CRSwNP 鼻竇粘膜組織中高表達，且與TLR4 呈負相關，提示二者可能存在交互作用，同時參與CRSwNP 患者病情的發展。而本研究通過將相關的變量納入Logistic回歸分析結果說明高YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA 表達量及組織EOS 增多可作為預測CRSwNP 預后復發的相關指標。

綜上所述，本研究提示YKL-40、TLR4、NF-κB及組織EOS 比例在CRSwNP 中呈高表達，可作為影響CRSwNP 預后復發的獨立危險因素，對臨床預測CRSwNP 患者病情發展有重要意義。