EB病毒實驗室檢測技術研究進展

麻婷婷 許四宏 周海衛

EB 病毒（epstein-barr virus，EBV）于1964年在伯基特淋巴瘤（burkitt's lymphoma，BL）的活組織檢查中發現并分離［1］。EBV 屬于γ 皰疹病毒亞家族，是9 種已被確認的僅感染人類的病毒之一［2］。EBV 為二十面體、十二聚體門戶結構（病毒的基因組轉位裝置）和衣殼相關的表皮復合體結構［3］。EBV 基因組約172 kb，由一個能編碼多于85 種基因的線性雙鏈DNA 分子組成。其編碼基因目前已知有6 種核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA），3 種潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP），小非聚腺苷化RNAs，EBV 編碼的小RNA（EBV encoded small RNA，EBER）1 和2，微小RNA 和幾種早期裂解基因［4］。

EBV 主要在口咽部上皮細胞增殖，口咽分泌物中存在大量病毒，排毒時間可達數月，某些病毒攜帶者甚至可間斷或持續排毒數年。EBV 可感染T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、鼻咽和口咽鱗狀上皮細胞、唾液腺和胃腺、甲狀腺腺上皮細胞、平滑肌和卵泡樹突狀細胞等多種細胞和組織。依據國際癌癥研究署對致癌因子的分類標準，EBV 被列為第一類癌因子［5］。EBV 感染與霍奇金淋巴瘤（hodgkin's lymphoma，HL）、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）、BL、鼻咽癌及部分類型胃癌和乳腺癌等有關［6-8］。EB 病毒感染孕婦后，會導致流產、胎死宮內、早產、胎兒畸形及新生兒感染等情況。EBV 感染兒童后的主要引發傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）、EBV 相關嗜血淋巴組織增多癥和X 連鎖淋巴組織增生綜合征等。EBV 有多種實驗室檢測技術，本文主要介紹各種檢測技術的特點和預期用途，以便選擇有效的方法精準的監測和診斷疾病。

1 EBV 檢測技術

EBV 在原發感染上皮細胞后，潛伏感染B 淋巴細胞［5］。正常攜帶者體內，病毒持續存在于記憶B細胞內，開始產生免疫球蛋白［9］。EBV 感染B 細胞后，延遲程序相關的基因和轉錄本會得到表達，使病毒在記憶B 細胞中保持休眠狀態，在B 細胞存在的任意粘膜部位間歇性地激活。EBV 進入B 細胞后以兩種形態存在，第一種是病毒基因組直接整合至宿主基因組上以原病毒形式存在，第二種是以圓形游離態存在于細胞核內，通過表達延遲基因，驅動宿主細胞的延遲和存活。B 細胞內延遲基因的表達使其轉化為淋巴細胞系而導致形成B 細胞源性淋巴瘤。在免疫功能正常的個體內，EBV 特異性淋巴細胞發揮作用使病毒的滴度受到抑制［10］。然而，EBV 在上皮細胞裂解期基因表達時，病毒可轉為潛伏期基因表達，導致上皮細胞向永久增殖細胞轉化，形成上皮細胞源性惡性腫瘤。EBV 檢測應用主要有以下幾方面：①以EBV 作為生物標記物診斷和評估腫瘤擴散及治療監測，②EBV 感染疾病的感染階段分期，③器官移植和免疫缺陷疾病患者的EBV 相關疾病的早篩和監測等。目前，EBV 的檢測方法主要包含血清學和分子生物學方法［11］。

1.1 EBV 細胞培養檢測

細胞培養技術是一種精確的半定量方法，但EBV 僅在非洲淋巴瘤細胞、IM 患者血液、健康人腦細胞和白血病細胞等培養中繁殖，其生長條件要求比較苛刻，細胞培養技術需要專業人員在特殊實驗室里操作，價格昂貴，且培養耗時較長（4～8周）。目前該技術主要用于檢測和半定量病毒或潛伏感染的B 淋巴細胞；其在臨床使用較少。

1.2 EBV 原位雜交檢測

原位雜交是檢測組織樣本中EBV 的金標準。EBV 的轉錄本在其感染的腫瘤細胞和IM 患者的淋巴細胞中均得到表達。EBV 主要轉錄本是定位于細胞核或細胞質的EBER1 和EBER2。EBER1和EBER2 可以抑制干擾素介導的細胞凋亡和抗病毒活性。與處于沉默狀態的病毒基因組相比它們有很高的拷貝數，可以作為檢測組織樣本中EBV潛伏感染的標記物［12］。原位雜交使用EBV 轉錄本作為標記物。該方法主要依據組織的細胞學和病理學對EBV 定位。由于EBV 相關的惡性腫瘤在早期已存在，EBER 信號也用于相關腫瘤的早期篩查。也可利用EBER 信號早期識別由EBV 引起的移植后淋巴增生性疾?。╬ost-transplant 1ymphoproliferative disorder，PTLD）及鑒別診斷包括IM、HL和/或NHL 的疾病。該方法存在局限性如在口腔毛狀粘膜白斑病中，EBV 轉錄本可能會下調。由于RNA 降解檢測結果可能會出現假陰性。該方法只適用于細胞，操作繁瑣耗時，同時需要特殊的技能。

1.3 EBV 嗜異凝集抗體檢測

嗜異凝集抗體檢測（heterophile antibody test，HAb）是常用的血清學試驗，是一種簡單但非特異性的檢測。HAb 依賴于患者的血清或血漿對馬、山羊或綿羊紅細胞的凝集能力。正常情況下，抗體在IM患者中能檢測到，但在許多其他疾病中沒有。在EBV 感染過程中，85%～90%的成年人和青少年呈陽性，其中約50%在第一周的HAb 檢測呈陽性［13］。HAb 通常用于原發性和復發性感染的診斷和篩查，它是IM 的一種敏感診斷測試。但是該方法存在非特異性，無法與其他原發性疾病（如病毒性肝炎、風疹、瘧疾和艾滋?。?、惡性腫瘤和自身免疫性疾病區分。只有大約10%～30%的兩歲以下兒童和50%的2～5 歲兒童呈陽性，因此國內不推薦HAb 用于診斷兒童EBV 原發性感染引起的IM［14-15］。

1.4 EBV 特異性抗體檢測

人類抵擋病毒入侵的第一道防線是免疫系統，其中的自然殺傷細胞和淋巴細胞發揮主要作用。然而，這種防御系統無法全部摧毀病毒，只可以使病毒維持較低的濃度或處于休眠狀態。EBV感染細胞以后，可表達衣殼抗原（viral capsid antigen，VCA）、早期抗原（early antigen，EA）、膜抗原（membrane protein，MA）和EBNA 等，每種抗原會表達刺激相應抗體的產生，具體過程參見圖1。原發感染過程中VCA 首先刺激產生IgM 和IgG 抗體，IgM 抗體在最早出現持續1～2 個月，IgG 抗體出現較遲持續數年。但原發性感染的兒童和成人并不總是VCA IgM 抗體呈陽性［16］。EA 是在病毒進入增殖期初期時形成的抗原，其IgG 抗體于發病后3～4 周達高峰，可持續3～6 個月是新近感染或EBV 活躍增殖的標志。MA 的IgG 抗體和EBNA的IgG 抗體于發病后3～4 周出現，終生持續存在，均是既往感染的標志。

圖1 EBV 感染后不同抗體的滴度變化［17］Figure 1 Titer changes of different antibodies after EBV infection［17］

與HAb 相比特異的EBV 抗體測試較為繁瑣耗時，更昂貴。而且，這些檢測需要特殊的底物或抗原。針對EBV 抗體（VCA-IgG、VCA-IgM、EBNAIgG、EBNA-IgM 和EA-IgG）有不同類型的特異檢測。特異抗體檢測在我國鼻咽癌臨床檢測中應用廣泛?！侗茄拾酥疚锱R床應用專家共識》指出EBV是鼻咽癌標記物中應用最廣泛、最成熟的診斷和預后判斷標志物［18］。其中VCA-IgM 抗體可以作為急性感染的標志物，適用于病毒感染早期診斷；VCAIgG 抗體可以用于鼻咽癌篩查和早期診斷；NA-IgG抗體的滴度動態監測對鼻咽癌的療效監測和預后判斷有一定作用。多種抗體與DNA 聯合檢測能大大提高鼻咽癌檢測的敏感度。EBV 抗體檢測常規包括免疫熒光法（immunofluorescence assays，IFAs），酶聯免疫法（enzyme immunoassays，EIAs）和與化學發光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）聯合的western blot 檢測。

IFAs 是金標參照法，經常用于檢測EBV 轉化的BL 細胞系（如Raji 細胞系），EIAs 對該檢測的特異性與IFAs 相似。因利用合成或純化天然蛋白，EIAs 是檢測EBV 特異性檢測的主要方法。IFAs特異性較高，可以推算EBV 感染的分期，但其高度可變，缺乏標準化。EIAs 更加快速，可以大批量自動化檢測，價格較低，但也欠缺標準化。一項研究表明，有些EIAs 與參考的IFAs 在感染分期方面結果非常一致，因此可能成為金標準IFAs 的替代品［19］。EIAs 和IFAs 仍需要免疫印跡和特異性IgG抗體的親和測試輔助診斷測試以確證急性感染或其他感染階段。CLIA 可以區分原發性感染和復發性感染且敏感度和特異性較好。Western blot 具有高特異性，能夠從血清中對EBV 感染階段分期，是針對幾種抗原的EBV 的特異性抗體檢測，但是其缺乏緩沖條件及重組抗原和細胞系裂解物的結合的標準且價格昂貴。為了更準確地診斷EBV 相關疾病仍需要一些輔助診斷試驗如親和性試驗［20］。

親和性檢測是抗原-抗體復合物與尿素短暫孵育后測定其親水性。高活性抗體能夠與抗原結合，而低活性抗體在添加尿素后親和性被消除［21］。親和性提供了抗體與多價抗原結合強度的信息。特異性抗體檢測主要用于確定病毒感染狀態又可以用于疾病鑒別診斷；抗VCA-IgG、抗VCA-IgM和抗EBNA-IgG 抗體三者的檢測結果可以評價患者免疫功能狀態及EBV 感染的分期［14］。VCA IgG親和度檢測可以在VCA IgM 缺失的情況下區分原發性和既往感染。然而由于母體抗體的存在，親和性檢測不能用于新生兒［20］。

1.5 EBV 核酸載量檢測

在過去的20年里，使用核酸擴增技術檢測外周血中的EBV 載量已經成為診斷和監測免疫缺陷宿主EBV 感染和相關疾病的重要工具。實體器官接受者、干細胞移植接受者和其他免疫缺陷宿主中，EBV 病毒載量檢測可以幫助診斷和管理EBV相關疾病。最重要的限制因素是缺乏定義臨床相關斷點的數據和適用于所有機構的試驗的性能規范。由于EBV 載量監測尚未在實驗室之間標準化，因此確定載量水平和EBV 疾病同這些患者中存在的可能性聯系時存在困難。雖然在一個實驗室EBV 病毒載量結果的連續監控已被證明與疾病結果是一致的，但是不同實驗室之間EBV 載量測定的結果與疾病的關系無法確定。因此，各機構需要審查其EBV 載量的測定結果并將其與臨床相關事件相關聯，以確定患者的適當閾值。由于各實驗室的結果不一致，接受連續監測的患者即使在出院后也需在同一實驗室進行病毒載量測量，以確保隨時間推移的病毒載量的可靠性。盡管世界衛生組織（world health organization WHO）已建立了第一代EBV 核酸國際標準品（NIBSC 編號為09/260），我國器審中心也已發布《EB 病毒核酸檢測試劑注冊技術審查指導原則》對試劑研發及生產進行指導，同時行業標準《EB 病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）》也正在制定中，但EBV 載量測定仍需要進一步標準化［22］。定量聚合酶鏈反應方法依賴于保守核酸序列的擴增，并利用熒光探針或插入染料來量化目的核酸。由于反應混合物包含在無菌、封閉的容器中，擴增子污染的風險較低。但是，不同實驗室間診斷工具、設備和程序的變化可能會使檢測結果不同。而且，對于用于研究EBV-DNA的理想樣本類型（組織、外周血單核細胞、血清或血漿）存在很大爭議［23］。EBV-DNA 的研究對免疫缺陷患者很有價值，因為他們的病毒載量比健康攜帶者高，特別是對于血清學檢測結果陰性或不明確的患者［24］。此外，EBV-DNA 可在與EBV 相關的惡性腫瘤患者血液中裂解腫瘤的游離體或病毒粒子中檢測到［24］。除了由于血腦屏障的保護而導致血液水平下降的艾滋病相關腦瘤患者外，檢測EBV-DNA對EBV 相關腫瘤患者非常有價值。

2 總結與展望

研究表明EBV 與腫瘤（免疫細胞性淋巴瘤、BL、HL、NHL 和鼻咽癌）和許多自身免疫性疾病（類風濕關節炎、干燥綜合征、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化）存在相關性。上述EBV 病毒檢測方法各有優缺點，應根據實際情況選擇合適的檢測手段，必要時可將兩種或多種方法聯合使用，保證檢測結果更真實可靠。同時，需要進一步的證據和共識來對程序標準化，如樣品類型、制備、引物/探針設計、設備、方案、報告單元和干預閾值。因此，研究者在努力闡明EBV 相關疾病發病機制和研發保護性疫苗的同時還需要標準化這些指標，為EBV 相關臨床病癥的診斷和治療提供更可靠的依據和參考。