宮頸病變與Treg轉錄因子表達及細胞因子水平的關系

梅琳琳 王雅莉 田曉娜 宋雙

宮頸癌（cervical cancer）是女性最常見的生殖系統惡性腫瘤，發病率及病死率均呈逐年升高趨勢，嚴重威脅我國女性的健康［1-2］。近年來，越來越多的學者開始關注宮頸癌的發病機制，其中免疫逃逸與宮頸癌之間的關系被多項研究證實，多種免疫細胞在宮頸癌病灶及患者外周血中均存在異常［3-5］。調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）是CD4+T 細胞中具有免疫抑制作用的亞群，在轉錄因子Foxp3 的作用下分化成熟并通過分泌白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）以及轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）來實現對免疫應答的負性調控，能夠抑制機體的抗腫瘤免疫應答、促進腫瘤細胞發生免疫逃逸［6-8］。本研究將觀察了宮頸癌組織中Treg 轉錄因子Foxp3 表達及細胞因子IL-10、TGF-β1 含量的變化并分析了其與臨床病理特征、增殖基因表達的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年3月至2018年12月期間在本院接受手術切除的宮頸癌患者，入組標準：①經術后病理診斷為宮頸癌；②臨床病理資料完整；③留取宮頸癌組織。④所有患者及家屬均簽署知情同意書。排除標準：①術前未接受放化療、生物治療；②既往有其他惡性腫瘤病史。選擇同期在本院接受手術切除的宮頸上皮內瘤變（CIN）患者及接受子宮切除術的子宮肌瘤患者，分別留取CIN 組織及正常宮頸組織。宮頸癌患者共84 例，年齡38～62 歲、平均（47.62±7.23）歲；CIN 患者共38 例，年齡33～59 歲、平均（46.48±8.65）歲；子宮肌瘤患者共60 例，年齡38～64 歲、平均（48.14±9.14）歲。宮頸癌患者、CIN 患者、子宮肌瘤患者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

采用RIPA 裂解液（上海碧云天公司）、BCA 試劑盒（上海碧云天公司），Foxp3、cyclinD1、p53 的單克隆一抗（SantaCruz 公司），IL-10、TGF-β1 的酶聯免疫吸附法（Elisa）檢測試劑盒（上海西唐公司），凝膠成像儀（Bio-rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 Foxp3、cyclinD1、p53 表達的檢測

取適量宮頸癌組織、CIN 組織、正常宮頸組織，加入RIPA 裂解液提取蛋白，采用BCA 試劑盒檢測總蛋白含量，取30 μg 總蛋白與上樣緩沖液混合，加入聚丙烯酰胺凝膠后進行電泳、電轉膜，用5%脫脂牛奶封閉NC 膜兩小時后4℃孵育1∶1 000稀釋的Foxp3、cyclinD1、p53、β-actin 第一抗體過夜；第二天用第二抗體孵育NC 膜兩小時后加入ECL 顯影液，在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，以β-actin為內參、根據條帶灰度值計算蛋白表達量。

1.3.2 IL-10、TGF-β1 含量的檢測

取適量宮頸癌組織、CIN 組織、正常宮頸組織，加入RIPA 裂解液提取蛋白，采用Elisa 試劑盒檢測IL-10、TGF-β1 的含量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組組織中Foxp3 表達及IL-10、TGF-β1 含量的比較

與正常宮頸組織比較，宮頸癌及CIN 組織中Foxp3 的表達量及IL-10、TGF-β1 的含量均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與CIN 組織比較，宮頸癌組織中Foxp3 的表達量及IL-10、TGF-β 1 的含量均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 宮頸癌、CIN 及正常宮頸組織中Foxp3 的蛋白條帶Figure 1 Protein bands of Foxp3 in cervical cancer，CIN and normal cervical tissues

表1 宮頸癌、CIN 及正常宮頸組織中Foxp3 表達量及IL-10、TGF-β1 含量的比較（±s）Table 1 Comparison of Foxp3 expression，IL-10 and TGF-β 1 Contents in each groups（±s）

表1 宮頸癌、CIN 及正常宮頸組織中Foxp3 表達量及IL-10、TGF-β1 含量的比較（±s）Table 1 Comparison of Foxp3 expression，IL-10 and TGF-β 1 Contents in each groups（±s）

注：與正常宮頸組織比較，aP＜0.05；與CIN 組織比較，bP＜0.05。

組織來源正常宮頸組織CIN 組織宮頸癌組織F 值P 值n 60 38 84 Foxp3表達量0.93±0.15 1.44±0.20a 1.89±0.41ab 189.938 0.000 IL-10（ng/mL）0.83±0.17 1.51±0.32a 2.11±0.52ab 237.751 0.000 TGF-β1（ng/mL）0.74±0.20 1.32±0.28a 1.89±0.44ab 203.475 0.000

2.2 宮頸癌中Foxp3、IL-10、TGF-β1 表達的相關性

宮頸癌中Foxp3 的表達量與IL-10、TGF-β1 的含量均呈正相關關系，r分別為0.351、0.283，P＜0.05。

2.3 不同臨床病理特征宮頸癌組織中Foxp3 表達及IL-10、TGF-β1 含量的比較

不同年齡、病灶直徑的宮頸癌組織中，Foxp3 的表達量及IL-10、TGF-β1 的含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；高危HPV 感染、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ、低分化、有淋巴結轉移的宮頸癌組織中Foxp3 的表達量及IL-10、TGF-β1 的含量明顯高于無高危HPV 感染、FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無淋巴結轉移的宮頸癌組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同臨床病理特征宮頸癌組織中Foxp3 表達量及IL-10、TGF-β1 含量的比較（±s）Table 2 Comparison of Foxp3 expression,IL-10 and TGF-β 1 Contents in cervical cancer tissues with different clinicopathological characteristics（±s）

表2 不同臨床病理特征宮頸癌組織中Foxp3 表達量及IL-10、TGF-β1 含量的比較（±s）Table 2 Comparison of Foxp3 expression,IL-10 and TGF-β 1 Contents in cervical cancer tissues with different clinicopathological characteristics（±s）

臨床病理特征年齡n 34 46病灶直徑分類＜40 歲≥40 歲t 值P 值＜3 cm≥3 cm t 值P 值28 52高危型HPV 感染否是18 62 FIGO 分期46 34組織分化程度t 值P 值Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳt 值P 值低分化中高分化t 值P 值33 47淋巴結轉移否是48 32 t 值P 值Foxp3 表達量1.95±0.48 1.88±0.37 0.737 0.463 1.99±0.51 1.85±0.35 1.448 0.152 1.51±0.34 2.21±0.62 4.580 0.000 1.58±0.31 2.19±0.59 5.990 0.000 2.13±0.66 1.64±0.28 4.549 0.000 1.67±0.33 2.14±0.62 4.407 0.000 IL-10（ng/mL）2.06±0.48 2.17±0.60 0.886 0.378 2.02±0.42 2.19±0.66 1.233 0.221 1.67±0.38 2.58±0.61 5.985 0.000 1.75±0.33 2.51±0.57 7.509 0.000 2.60±0.59 1.62±0.42 8.685 0.000 1.61±0.29 2.63±0.63 9.790 0.000 TGF-β1（ng/mL）1.86±0.51 1.93±0.36 0.720 0.474 1.85±0.34 1.95±0.52 0.916 0.362 1.45±0.34 2.32±0.51 6.796 0.000 1.58±0.38 2.20±0.47 6.520 0.000 2.26±0.50 1.51±0.37 7.713 0.000 1.40±0.30 2.37±0.56 10.050 0.000

2.4 各組組織中cyclinD1、p53 表達的比較

與正常宮頸組織比較，宮頸癌及CIN 組織中cyclinD1的表達量明顯增加，p53的表達量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與CIN 組織比較，宮頸癌組織中cyclinD1的表達量明顯增加，p53 的表達量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 宮頸癌、CIN及正常宮頸組織中cyclinD1、p53蛋白條帶Figure 2 Protein bands of CyclinD1 and p53 in cervical cancer,CIN and normal cervical tissues

表3 各組組織中cyclinD1、p53 表達量的比較（±s）Table 3 Comparison of CyclinD1 and p53 expression in each groups（±s）

表3 各組組織中cyclinD1、p53 表達量的比較（±s）Table 3 Comparison of CyclinD1 and p53 expression in each groups（±s）

注：與正常宮頸組織比較，aP＜0.05；與CIN 組織比較，bP＜0.05。

組織來源正常宮頸組織CIN 組織宮頸癌組織F 值P 值n 60 38 84 cyclinD1 0.92±0.16 1.26±0.20a 2.02±0.42ab 175.582 0.000 p53 1.05±0.23 0.55±0.08a 0.22±0.05ab 332.842 0.000

2.5 宮頸癌中Foxp3 表達量及IL-10、TGF-β1 含量與cyclinD1、p53 表達量的相關性

Foxp3 的表達量及IL-10、TGF-β1 的含量與CyclinD1 的表達量呈正相關，與p53 的表達量呈負相關，見表4。

表4 宮頸癌中Foxp3 表達量及IL-10、TGF-β1 含量與cyclinD1、p53 表達量的相關性Table 4 Correlation between Foxp3 expression，IL-10，TGF-β1 and CyclinD1，p53 expression in cervical cancer

3 討論

免疫逃逸與多種惡性腫瘤的發生發展均存在密切關系。近年來，免疫逃逸在宮頸癌的發生發展過程中的作用也受到了越來越多的關注［9］，已有多項研究報道宮頸癌患者外周血中Treg 細胞的比例以及血清中Treg 細胞因子的含量均明顯增多［10-12］。Treg 是具有免疫抑制作用的CD4+T 細胞亞群，Foxp3 是該細胞亞群的標志性轉錄因子，能夠介導Treg 的分化成熟；分化成熟的Treg 能夠分泌具有免疫抑制活性的IL-10、TGF-β1，抑制多種免疫細胞的分化成熟、免疫細胞因子的分泌，進而實現對免疫應答的負性調控［13-15］。

高危型HPV 感染是宮頸癌發病的獨立危險因素，局部組織中感染高危型HPV 后，病毒基因會整合進入宿主細胞的基因組，引起宿主細胞內多種基因表達的改變，進而通過相應基因的功能來影響細胞的生物學特性［16］。本研究結果說明高危型HPV感染可能增加Foxp3 的表達并促進Treg 分化成熟、分泌IL-10 及TGF-β1；而不斷分化成熟的Treg 又能介導免疫抑制作用、抑制免疫應答對病毒的清除，進而造成的高危型HPV 的持續感染。由此，高危型HPV 感染與Treg 分化成熟形成了相互促進、相互增強的循環，共同參與了宮頸癌的發生發展。

在宮頸癌的發生發展過程中，當宮頸癌細胞發生免疫逃逸后，癌細胞會出現過度的增殖、遷移、侵襲，進而引起腫瘤相應病理特征的改變。本研究通過分析不同病理特征宮頸癌中Treg 的差異可知：隨著FIGO 分期增加、分化降低、淋巴結發生轉移，Foxp3 的表達明顯升高，說明Treg 的增加能夠促進宮頸癌的病理進程。在宮頸癌的病理進程中，癌細胞的惡性增殖是重要的生物學特征，cyclinD1及p53是與增殖密切相關的基因，前者加速細胞周期并促進增殖，后者誘導細胞凋亡并抑制增殖［17］。研究發現Treg 的增多能夠造成促增殖基因cyclinD1表達增多、增殖抑制基因p53表達減少，說明Treg 細胞功能的改變與增殖基因表達的異常有關。這也與宮頸癌病理特征的改變相吻合，進而說明Treg 增多促進了宮頸癌病情的發展。

綜上所述，宮頸癌組織中Treg 轉錄因子Foxp3及細胞因子IL-10、TGF-β1 的表達明顯增加且與病理特征有關，高危型HPV 感染可能是促進Treg分化成熟的因素之一，而Treg 分化成熟后又能夠促進癌細胞的增殖并引起病情的發展。在今后的研究中，可以設計宮頸癌移植瘤動物模型來驗證Treg 對腫瘤生長、腫瘤細胞增殖的影響。