直腸癌患者BRMS1mRNA、PTNmRNA的表達及臨床意義

馬歡 焦英華 李曙光 張賢雨 魏玉磊 田桂英 盧秀榮 原娜

直腸癌是指發生在齒狀線至直腸乙狀結腸交界處的腫塊，是消化道最常見的惡性腫瘤，直腸癌患者臨床典型癥狀以排便習慣改變、里急后重、肛門墜漲等為主，當腫瘤侵犯膀胱、尿道、陰道等周圍臟器時可引起尿路刺激癥狀、骶部及會陰部疼痛及下肢水腫等，此外，直腸癌還可累及多器官，引起重要器官功能不全，具有較高的死亡率［1］。消化道惡性腫瘤微轉移是影響患者預后生存的關鍵，而浸潤和轉移作為一個復雜的過程，涉及腫瘤細胞和細胞外基質的某些重要物質的相互作用［2］。近年來，分子生物學的研究發現某些腫瘤轉移抑制基因對抑制腫瘤細胞侵襲有重要作用，故相關分子指標成為研究的熱點［3］。其中，乳腺癌轉移抑制基因（breast cancer metastasis suppressorl，BRMS1）及多效生長因子（Pleiotrophin，PTN）分別作為重要的腫瘤轉移抑制基因及生長因子，在細胞增殖與轉移中均發揮關鍵作用［4-5］。本研究就直腸癌患者BRMS1mRNA、PTNmRNA 的表達及臨床意義進行分析，旨在為臨床治療提供思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年5月本院收治的73例直腸癌患者臨床資料，納入標準：①所有患者有明確的病理學診斷依據，均確診為直腸癌；②入組前未接受放療及化療；③腫瘤直徑≤5 cm；④臨床資料完整且真實；排除標準：①合并血液疾病者；②嚴重精神疾患或癡呆等無法配合本研究者；③存在除直腸癌以外其他原發性惡性腫瘤者；④合并風濕免疫及結締組織病變者。其中男性41例，女性32 例；年齡35～72 歲，平均年齡（56.45±5.71）歲。收集腫瘤組織及腫瘤旁（距離直腸癌組織5 cm 以上）的正常直腸粘膜組織，分別作為直腸癌組（n=73）和癌旁組（n=73）。本研究經本院倫理委員會批準，受試者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

收集所有患者臨床資料，比較BRMS1mRNA、PTNmRNA 在直腸癌及癌旁正常組織的表達情況；分析BRMS1mRNA、PTNmRNA 與直腸癌患者各病理參數的相關性，記錄所有患者在隨訪時間內存活及死亡情況，采用多元Logistic 回歸分析影響直腸癌患者預后生存的危險因素，繪制Kaplan-Meier生存曲線研究BRMS1mRNA、PTNmRNA 對患者預后生存的影響。

1.3 觀察指標

1.3.1 主要儀器與試劑

ABI PRISM 7000 熒光定量PCR 分析儀購自美國應用生物系統公司，Biophotometer 核酸測定儀購自德國Eppendoff 公司。Trizol RNA 提取試劑盒、M-MLVcDNA 合成試劑盒、PCR 反應試劑、RNase-free 試劑購自試劑由上海生物工程有限公司提供，BRMSl 及3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）RT 引物、熒光定量PCR 引物、熒光探針及用來制作標準曲線的人工合成BRMSl 及GAPDHcDNA均購自上海基康生物技術有限公司。即用型非生物素免疫組化Elivision TM plus 免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司，人重組PTN細胞因子、PTN單克隆抗體以及PTN多克隆抗體購自美國SantaCruz 公司，光學顯微鏡購自德國Leica 公司。

1.3.2BRMS1mRNA、PTNmRNA 的表達檢測

BRMS1mRNA 的表達檢測：BRMSl 上游引物5′-GACCGCCAGAGCCrllG-GA3′；下游引物：5′-CTGCCTCTGGCGTGCAG-3′；熒光探針：5-FAMCAGCTCTGAArrGGTGG-MGB-3′；GAPDH 上游引物：5′-CATCAATGACCCCTIlG-3′；下游引物：5′-CATGGGTGGAATCATATTFGGAAC-3′；熒光探針：5′-VIC-CCTCAACTACATGGTITAC-MGB-3′。取組織50～100 μg，Trizol 法提取組織總RNA，核酸蛋白紫外分析檢測RNA 質量和濃度。以RT-PCR 試劑盒試劑進行RT 反應。首先反轉錄為c-DNA，反應條件：37℃1 h，95℃10 min 滅活MMLV，終止逆轉錄。PCR 反應條件：94℃1 min；58℃1 min，72℃1 min，循環35 次，最后72℃延長7 min。行1.5%瓊脂糖電泳鑒定，用凝膠成像分析系統檢測BRMS1和β-action mRNA 的表達強度。PTNmRNA 的表達檢測采用原位雜交法，嚴格按照說明書進行操作，陰性對照則使用PBS 替代雜交液。

1.4 隨訪方法

隨訪從患者術后開始，直至患者死亡或本研究的隨訪結束，為期3年，截止于2020年5月31日。患者的隨訪時間分布在2 至36 個月，平均隨訪時間為（29.98±2.64）個月。對患者隨訪的方式主要采用電話隨訪及患者來院復查為主。在本研究中，總生存時間（overall Survival，OS）表示直腸癌患者從手術治死亡的時長［6］。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0 軟件進行統計分析，計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，行t檢驗；以Kaplan-Meier 生存曲線研究BRMS1mRNA、PTNmRNA 對患者預后生存的影響，采用多元Logistic 回歸分析影響直腸癌患者預后生存的危險因素，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組BRMS1mRNA、PTNmRNA 的表達情況比較

直腸癌組BRMS1mRNA 表達水平較癌旁正常組織低，PTNmRNA 陽性率較癌旁正常組織高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組BRMS1mRNA、PTNmRNA 的表達情況比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of BRMS1mRNA and PTNmRNA expression in 2 groups［n（%），（±s）］

表1 兩組BRMS1mRNA、PTNmRNA 的表達情況比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of BRMS1mRNA and PTNmRNA expression in 2 groups［n（%），（±s）］

組別直腸癌組癌旁組χ2/t 值P 值n 73 73 BRMS1mRNA 0.59±0.06 0.87±0.07 25.948＜0.001 PTNmRNA 陽性59（80.82）21（28.77）39.929＜0.001

2.2 BRMS1mRNA、PTNmRNA 與直腸癌患者不同病理參數的關系

不同性別、年齡者BRMS1mRNA、PTNmRNA表達差異無統計學意義，組織高分化、淋巴結無轉移、Ⅰ+Ⅱ期、無血性轉移、浸潤深度未及漿膜、腫瘤距肛緣距離≤7 cm 者BRMS1mRNA 表達水平較組織中低分化、淋巴結轉移、Ⅲ+Ⅳ期、血性轉移、浸潤深度達漿膜、腫瘤距肛緣距離＞7 cm 者高，PTNmRNA 陽性率較水平較組織中低分化、淋巴結轉移、Ⅲ+Ⅳ期、血性轉移、浸潤深度達漿膜、腫瘤距肛緣距離＞7 cm 者低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 患者預后情況及影響患者預后生存的單因素和多因素分析

截至隨訪結束，73 例直腸癌患者生存49 例，死亡24 例，死亡率為32.88%。

組織中低分化、浸及漿膜、TNM 分期：Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結轉移、BRMS1mRNA 低表達及PTNmRNA 陽性表達為影響直腸癌患者預后生存的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

2.4 BRMS1mRNA、PTNmRNA 表達與直腸癌患者預后生存的關系

不同BRMS1mRNA、PTNmRNA 表達情況下Keplan-meier 生存曲線明顯不同。見圖1。

表2 BRMS1mRNA、PTNmRNA 與直腸癌患者不同病理參數的關系（±s）Table 2 Relationship between BRMS1mRNA，PTNmRNA and different pathological parameters in patients with rectal cancer（±s）

表2 BRMS1mRNA、PTNmRNA 與直腸癌患者不同病理參數的關系（±s）Table 2 Relationship between BRMS1mRNA，PTNmRNA and different pathological parameters in patients with rectal cancer（±s）

病理參數χ2值性別年齡（歲）組織分化淋巴結轉移TNM 分期血性轉移浸潤深度腫瘤距肛緣距離（cm）男女＜55≥55高分化中低分化無有Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳ無有未及漿膜浸及漿膜≤7＞7（n=73）41 32 35 38 48 25 50 23 45 28 40 33 52 21 39 34 BRMS1mRNA 0.73±0.12 0.71±0.09 0.69±0.15 0.63±0.13 0.71±0.19 0.59±0.13 0.76±0.14 0.53±0.16 0.87±0.16 0.51±0.13 0.89±0.32 0.43±0.16 0.86±0.13 0.53±0.07 0.73±0.28 0.49±0.21 t 值0.756 1.830 3.191 6.232 10.017 7.513 10.977 4.093 P 值0.435 0.071 0.002＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 PTNmRNA 陽性（n=59）34（57.63）35（59.32）27（45.76）32（54.24）35（59.32）24（40.68）37（62.71）22（37.29）31（52.54）28（47.46）28（47.46）31（52.54）39（66.10）20（33.90）27（45.76）32（54.24）0.002 0.587 7.239 4.765 10.778 6.686 3.953 7.258 P 值0.961 0.444 0.007 0.029 0.001 0.010 0.047 0.007

表3 影響直腸癌患者預后生存的單因素和多因素分析Table 3 Single factor and multiple factor analysis of prognostic survival in patients with rectal cancer

圖1 BRMS1mRNA、PTNmRNA 表達與直腸癌患者預后生存的關系Figure 1 BRMS1mRNA and PTNmRNA expression and prognosis survival in patients with rectal cancer

3 討論

直腸癌是臨床多發的惡性腫瘤，近年來我國直腸癌發病率逐年上升，占腫瘤的死因亦順位前移［7］。盡管目前直腸癌的外科手術已取得長足的進步，但術后復發轉移及死亡的風險仍較高［8］。本組研究結果基本與既往研究相似，故尋求有效治療靶點對降低直腸癌患者死亡率有重要意義。

腫瘤轉移侵襲是導致患者死亡的重要原因，其過程包含腫瘤細胞的移行、擴散、浸潤及在轉移部位的繁殖等。在惡性腫瘤的轉移過程中，轉移抑制基因的作用十分關鍵［9］。BRMS1基因編碼一種轉移抑制因子，在多種類型的腫瘤轉移中均有報道［10］。研究表明具有高度轉移潛能的惡性腫瘤細胞，一般表現為BRMSI 表達降低成缺失，將BRMSl 轉染到這些細胞中，可抑制其轉移潛能。Sadat 等［11］發現BRMS1的表達與乳腺癌淋巴結轉移呈負相關，表明BRMS1有抑制腫瘤轉移的作用。Penglong 等［12］則發現BRMS1L 的過表達抑制了上皮性卵巢癌細胞的遷移和侵襲，認為其可作為BRMS1L 可作為上皮性卵巢癌患者預后的生物標志物和潛在的治療靶點。雖然BMRS1基因的腫瘤轉移抑制作用得到證實，但其作用機制仍不清楚。由于BMRS1 可使縫隙連接蛋白亞基Cx43 表達上調，恢復癌細胞與正常組織細胞間隙連接及信號傳導，抑制癌細胞脫離原發灶而發生轉移，故可推測BRMS1抑制直腸癌轉移的機制可能與細胞間隙連接、信號傳導有關［13］。本研究結果提示BRMS1L 參與直腸癌的轉移與侵襲。結果證實BRMS1mRNA表達情況與直腸癌的惡化程度關系密切，可將其作為預測直腸癌癌患者預后的分子標志物之一。

PTN基因是已知的生長因子中最保守的基因之一，其與腫瘤發生和發展的關系得到多項研究的認證［14］。PTN基因作為一種原癌基因，屬MDK 家族。體外培養發現，PTN可促進胚胎神經元的分化和神經突的生長，并可促進纖維細胞的肺裂增殖，故PTN也被稱作軸突生長刺激因子［15］。本研究結果說明PTN與直腸癌的發生、轉移和侵襲關系密切。與Wang 等［16］研究結果相似，進一步提示其可作為潛在的治療靶點，進而提高患者生存時限。此外，本研究結果顯示組織中低分化、浸及漿膜、TNM分期：Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結轉移為影響直腸癌患者預后生存的獨立危險因素。因此，需加強對直腸癌的早期篩查、早期診斷、早期治療，并重視對合并高危因素患者的預后評估，進一步提高治愈率。

綜上所述，BRMS1mRNA、PTNmRNA 在直腸癌患者中呈異常狀態，并與患者預后生存關系密切，可作為預測直腸癌患者預后生存的分子標志物和腫瘤治療的潛在的靶點。本研究中存在一些不足之處在于納入樣本量較少，隨訪方式缺乏臨床驗證，未來可擴大樣本量，加強隨訪真實性。