副溶血性弧菌質(zhì)粒DNA參考物質(zhì)的研制

林曉峰 努色熱提·阿布都沙拉木 袁暮云 許龍巖★ 陳瑤★

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種革蘭氏陰性嗜鹽性細(xì)菌，由VP引起的食源性疾病已超過(guò)沙門(mén)氏菌，躍居于食源性致病菌的首位，成為當(dāng)前世界上分布最廣泛、最常見(jiàn)的疾病之一，是國(guó)內(nèi)外極為重視的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題之一［1］。一系列研究表明致病性VP的毒力因子主要有溶血性毒素、脂多糖、尿素酶等。其中，溶血素類(lèi)毒力因子包括tdh、tlh、trh和能刺激tdh的溶血功能toxR［2-3］。在VP檢測(cè)中同時(shí)檢測(cè)特異性和毒力基因?qū)⒂欣谖覀兛焖倥袛郪P感染的危險(xiǎn)性。具有序列和量值可溯源性的參考物質(zhì)將極大提高檢測(cè)能力和實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的可參考性［4-6］。目前應(yīng)用于副溶血弧菌檢測(cè)的核酸參考品尚十分缺乏，主要為從副溶血弧菌培養(yǎng)物中提取的細(xì)菌基因組?；蚪MDNA 作為參考品，難以同時(shí)為多個(gè)靶標(biāo)提供可溯源的定量參考，無(wú)法在多種檢測(cè)試劑和方法之間提供可參比的參考性［6-7］。因此，本研究擬構(gòu)建包含多個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)的質(zhì)粒核酸參考品，提高VP核酸檢測(cè)結(jié)果的可比性，解決病原核酸檢測(cè)能力快速發(fā)展與缺乏參考材料之間的矛盾。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

副溶血性弧菌檢測(cè)常用的目的基因序列tdh選取（LOCUS BA000032）、trh（GenBank：GU971654.1）、tlh（GenBank：EF640376.1）、toxR（847892-848770 LOCUS AB063113）。在選取基因的時(shí)候，盡量包含基因全長(zhǎng)，以保證所制備的核酸參考物質(zhì)可以模擬基因的完整的形態(tài)。以人工合成的方法將這四個(gè)基因串聯(lián)在一起（以不相關(guān)的基因片段aagtcg 隔開(kāi)），并克隆到pUC57 中以形成重組質(zhì)粒（圖1），大量培養(yǎng)重組大腸桿菌，經(jīng)提取和純化獲得重組質(zhì)粒DNA（pDNA）［8-9］。

1.2 純度檢驗(yàn)

采用紫外分光光度法對(duì)質(zhì)粒DNA 的純度進(jìn)行鑒定，通過(guò)測(cè)出樣品在260 nm、280 nm、230 nm波段的紫外光下的吸光度值（A260，A280，A230），確定樣品純度，排除RNA 和蛋白質(zhì)污染。

1.3 均勻性研究

按照《JJG1006-1994 一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》［6］使用紫外法對(duì)所制備的質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)的均勻性進(jìn)行檢驗(yàn)。瓶間均勻度檢驗(yàn)：隨機(jī)選擇10 管pDNA，并用UV 重復(fù)測(cè)量每管中提取的1 μL樣品3 次，取平均值。瓶?jī)?nèi)均勻度檢驗(yàn)，隨機(jī)選擇9 管pDNA，并從每管樣品的上層，中層和下層提取1 μL 測(cè)試樣品，紫外分光光度法用于定量樣品DNA 含量。通過(guò)方差分析（F 檢驗(yàn)法）分析測(cè)量結(jié)果并進(jìn)行判斷。根據(jù)公式①計(jì)算質(zhì)粒DNA 的瓶間不均勻性引起的不確定度（uh）：

其中：Q1為組間差方和，Q2為組內(nèi)差方和，v1為組間自由度，v2為組內(nèi)自由度，n 為組內(nèi)測(cè)量次數(shù)。

1.4 穩(wěn)定性研究

監(jiān)測(cè)質(zhì)粒DNA 在儲(chǔ)存期間的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，為期一年。每月對(duì)質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)隨機(jī)抽取3瓶，每個(gè)樣品的濃度重復(fù)測(cè)定3 次，綜合整理數(shù)據(jù)，對(duì)質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和不確定度的進(jìn)行評(píng)估。進(jìn)一步根據(jù)公式②計(jì)算質(zhì)粒DNA在12 個(gè)月內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性引起的不確定度（us）：

其中：β1是穩(wěn)定性線性模型中的斜率，S（β1）是斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，N 是穩(wěn)定性評(píng)估的總時(shí)間，N=12 個(gè)月。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)值的確定

質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)的濃度由8 家實(shí)驗(yàn)室用紫外方法協(xié)同測(cè)定，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)檢查確認(rèn)每組數(shù)據(jù)沒(méi)有異常值和顯著差異后，將8 家實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果平均值取作質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值。根據(jù)公式③計(jì)算質(zhì)粒DNA 在定值過(guò)程引入的不確定度（uq）：

其中：s 為總平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，p 為實(shí)驗(yàn)室數(shù)目。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度評(píng)估

質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)的不確定度主要來(lái)源于三部分，第一部分是由不均勻性帶來(lái)的不確定度（uh），第二部分是長(zhǎng)期保存穩(wěn)定性引入的不確定度（us），第三部分即定值時(shí)由定值方法和儀器引入的不確定度（uq）。然后按照公式④計(jì)算參考物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

計(jì)算擴(kuò)展不確定度時(shí)，應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子（k）。所以，擴(kuò)展相對(duì)不確定度計(jì)按公式⑤計(jì)算：

1.7 qPCR 實(shí)驗(yàn)

通過(guò)紫外法分別對(duì)提取的質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)及從VP 標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株中提取的gDNA進(jìn)行定量。根據(jù)公式⑥計(jì)算每微升質(zhì)粒DNA 和基因組DNA（gDNA）的拷貝數(shù)。

660×（DNA size bp）（g/mol）

根據(jù)副溶血性弧菌基因組大小3.29 Mbp 估算gDNA 的拷貝數(shù)，并基于5 179 bp 估算重組質(zhì)粒DNA 的拷貝數(shù)。制備10 倍稀釋系列制備2×106、2×105、2×104、2×103、2×102和2×101copies/mL 稀釋的樣品。質(zhì)粒DNA 和gDNA 均通過(guò)qPCR 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR 方案如下：94℃變性10 min 后，在94℃下30 s，58℃下45 s 擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。見(jiàn)表1。

表1 tdh，trh，tlh 和toxR 基因的引物和擴(kuò)增片段大小Table 1 Primer and amplicon for tdh，trh，tlh and toxR

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)用質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)建立qPCR 的檢測(cè)限（Limit of detection，LOD）和定量限（Limit of quantification，LOQ）來(lái)評(píng)估qPCR 的檢測(cè)范圍。并評(píng)估擴(kuò)增效率（e）和斜率（K）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率（e）和斜率（K），以評(píng)估gDNA的可替換性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 12.0 和Graphpad 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。均勻性測(cè)試使用單因素方差分析。穩(wěn)定性分析使用單向線性回歸分析來(lái)判定pDNA 的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。使用配對(duì)t檢驗(yàn)分析pDNA 與gDNA 的適用性結(jié)果。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒序列的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

成功合成了含有副溶血性弧菌tdh、trh、tlh及toxR基因的DNA 片段，并將其插入克隆載體pUC57 中，形成重組質(zhì)粒pDNA。pDNA 經(jīng)提取純化后，經(jīng)核酸電泳和測(cè)序證實(shí)，重組質(zhì)粒中插入片段的序列準(zhǔn)確度為100%，符合預(yù)期。見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒DNA 的測(cè)序圖Figure 2 Sequencing diagram of recombinant plasmid pDNA

2.2 純度驗(yàn)證

通過(guò)紫外法測(cè)的pDNA 的A260/A280的比值為（1.897±0.236），比值在1.8～2.0 間，且A260/A230的比值大于2.0。

2.3 均勻性檢驗(yàn)

分析結(jié)果表明，按照方差分析法（F-檢驗(yàn)法）在95%置信水平下，可以判斷質(zhì)粒DNA 的特性值在瓶?jī)?nèi)均勻性上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在瓶間均勻性分析中，F(xiàn)＞F0.05，通過(guò)比較物質(zhì)的不均勻所引起的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SH）和方法測(cè)量所造成的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S2），由于兩者相近，故瓶間不均勻性所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差最終需要合成到標(biāo)準(zhǔn)不確定度中。見(jiàn)表2。

表2 副溶血弧菌pDNA 均勻性檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistic results of homogenous test of pDNA VP

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

通過(guò)線性回歸模型作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)pDNAVP進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，通過(guò)12 個(gè)月采樣分析pDNAVP的濃度建立單項(xiàng)線性回歸方程Y=β1+β0，自由度為n-2 和P=0.95（95%置信水平）的學(xué)生分布t-因子等于0.183，結(jié)果提示|β1|＜t0.95，n-2·S（β1）（n-2 是自由度，S（b1）是斜率的不確定性）。見(jiàn)表3。

表3 副溶血性弧菌pDNA 長(zhǎng)期穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Statistic results of short-term stability of pDNA VP

2.5 標(biāo)準(zhǔn)值的確定

通過(guò)8 家實(shí)驗(yàn)室使用紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒DNA 的濃度，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)以所測(cè)定數(shù)據(jù)的總平均值χ2=29.62 μg/mL 為標(biāo)準(zhǔn)值。根據(jù)公式③計(jì)算質(zhì)粒DNA 在定值過(guò)程引入的不確定度（uq）：最終計(jì)算得出的定值過(guò)程引入的不確定度（uq）為0.296 μg/mL。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度評(píng)估

質(zhì)粒DNA 的不確定度包括來(lái)自于瓶間不均勻性引入的不確定度（uh）、長(zhǎng)期保存穩(wěn)定性引入的不確定度（us）、定值時(shí)引入的不確定度（uq）。根據(jù)公式④⑤計(jì)算質(zhì)粒DNA 的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。最終計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)不確定度（Ucrm）為1.534 μg/mL，擴(kuò)展不確定度（UCRM）為3.068 μg/mL（k=2）。

2.7 qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖3所示為使用所制備的質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)作為參照標(biāo)準(zhǔn)，建立qPCR 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性見(jiàn)表4。

2.8 質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)與副溶血性弧菌基因組DNA（gDNA）的可替代性研究

通過(guò)評(píng)估斜率和截距，在95%置信度下，可認(rèn)為gDNA 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線之間沒(méi)有顯著差異（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

3 討論

圖3 副溶血弧菌pDNA 建立tdh，trh，tlh 和toxR 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figuer 3 Standard curve of tdh，trh，tlh and toxR established by pDNA VP

表4 副溶血弧菌pDNA 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 4 Data for the standard curve established by pDNA VP

核酸技術(shù)的廣泛使用，讓核酸檢測(cè)參考品的需求進(jìn)一步提高。傳統(tǒng)的基因組參考品存在以下問(wèn)題：①單一菌株參考品難以覆蓋所有的檢測(cè)靶標(biāo)。實(shí)際操作中需要使用多種基因組參考品，繪制多條標(biāo)準(zhǔn)曲線才能完成病原體的全面的檢驗(yàn)。②序列和量值難以溯源，可以作為定性檢測(cè)，但是無(wú)法對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果進(jìn)行比較，也無(wú)法對(duì)實(shí)驗(yàn)室能力進(jìn)行評(píng)定。③生物安全性問(wèn)題。因此，亟待研發(fā)安全穩(wěn)定，能夠提供量值溯源能力的新型參考物質(zhì)［10-11］。目前在雙歧桿菌，H7 亞型禽流感病毒等多種病原體檢測(cè)的過(guò)程中，質(zhì)粒參考物質(zhì)的使用已經(jīng)得到了驗(yàn)證［12-13］。人工DNA 合成技術(shù)為核酸參考物質(zhì)的制備提供了新思路，這項(xiàng)技術(shù)可以通過(guò)人工合成來(lái)獲得完整的基因，并實(shí)現(xiàn)將多個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)自由組合起來(lái)作為檢測(cè)靶標(biāo)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)檢測(cè)目的基因的檢測(cè)進(jìn)行質(zhì)量參考。

表5 副溶血弧菌pDNA 和gDNA 標(biāo)準(zhǔn)品代替性研究Table 5 Substitution of pDNA VP and genomic DNA reference material

在此次實(shí)踐中，本文研制的檢測(cè)質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)涵蓋副溶血性弧菌多個(gè)檢測(cè)目的基因（tdh、trh、tlh及toxR基因），序列正確，純度高，均勻性好、可在-20℃條件下穩(wěn)定保存一年以上，并通過(guò)聯(lián)合定值的方式，使得標(biāo)準(zhǔn)品的量值可以溯源。相對(duì)于常用基因組參考品，質(zhì)粒參考品彌補(bǔ)了現(xiàn)時(shí)檢測(cè)中需要使用多種菌株基因組才能完成對(duì)副溶血弧菌特異性和毒力因子分析的短板。值得一提的是，使用基因組DNA 和質(zhì)粒DNA 作為模板生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線非常吻合，換而言之，本品可以代替副溶血性弧菌基因組DNA 用于副溶血性弧菌的核酸檢測(cè)［13-14］。

因此，副溶血性弧菌tdh、trh、tlh及toxR基因檢測(cè)質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)的研制，為副溶血性弧菌的相關(guān)核酸檢測(cè)提供了量值溯源的參照標(biāo)準(zhǔn)，為副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制提供了有力保障。該質(zhì)粒DNA 參考物質(zhì)的推廣應(yīng)用，可進(jìn)一步提高各實(shí)驗(yàn)室副溶血性弧菌相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目的水平和效率，保障各實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果的可比性，準(zhǔn)確性，提升各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的認(rèn)可度。