乳腺癌患者外周血miR-34a表達變化的臨床意義

王慶月 張晨輝 陳鈺

乳腺癌是我國發病率居首的女性惡性腫瘤，約20%乳腺癌患者首次就診時已經發展至局部晚期，在手術前進行新輔助化療是臨床常用的治療手段［1-2］。病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）是評價新輔助化療效果的重要指標，喬偉強等人通過Meta 分析研究發現新輔助化療后獲得pCR 的乳腺癌患者5年總生存率和無病生存率均明顯高于未獲得pCR 的患者［3］。在臨床實踐中，手術后病理檢查是評估pCR 的金標準，但是具有一定滯后性。在手術前預測新輔助化療的療效、篩選出能夠獲得pCR 的乳腺癌患者，對于選擇適用新輔助化療的患者具有指導意義。癌細胞對化療藥物的敏感性是影響化療效果的重要因素，多種微小RNA（microRNA，miR）被證實參與癌細胞化療敏感性的調控［4-6］。miR-34a 是一種具有抑癌作用的微小RNA，乳腺癌病灶內miR-34a 表達減少［7］，過表達miR-34a 能夠抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲［8］。因此，本研究將分析乳腺癌患者外周血miR-34a 表達與臨床病理特征及新輔助化療pCR 的相關性，旨在為尋找新輔助化療pCR 的早期預測標志物提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年5月至2019年5月期間在本院接受新輔助化療的乳腺癌患者作為乳腺癌組，納入標準：①經穿刺活檢診斷為浸潤性乳腺癌，臨床分期ⅡB～Ⅲ期；②接受TE 或TEC 方案新輔助化療；③臨床病理資料完整；④術前留取外周抗凝血樣本。排除標準：①入組前接受過放化療或其他抗腫瘤治療；②妊娠或哺乳期患者；③既往有其他惡性腫瘤病史。另取同期體檢的健康志愿者作為對照組。乳腺癌組共142 例，年齡34～64 歲、平均（51.32±9.29）歲，BMI（23.12±6.23）kg/m2；對照組共86 例，年齡33～60 歲、平均（49.95±11.32）歲，BMI（23.44±7.14）kg/m2。兩組間一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 外周血miR-34a 表達水平的檢測

取乳腺癌組和對照組的外周抗凝血標本，采用miR 提取分離試劑盒（北京天根公司，批號DP501）分離miR，而后采用miR cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根公司，批號KR211）將靜脈血中提取得到的miR 反轉錄為cDNA，最后采用miR熒光定量檢測試劑盒（北京天根公司，批號FP401）在熒光定量PCR 儀進行熒光定量PCR 檢測，反應結束后生成循環曲線并得到循環閾值，以U6 為內參，計算miR-34a 的表達量。

1.3 乳腺癌中bcl-2、CCND1、Notch1 表達的檢測

取乳腺癌組織，采用RIPA 裂解液對組織進行勻漿并提取蛋白，采用BCA 試劑盒測定蛋白含量，取含有20 μg 蛋白的樣本進行western blot 檢測，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳后電轉移至PVDF膜，1∶1 000 稀釋的bcl-2、CCND1、Notch1 一抗或1∶5 000 稀釋的β-actin 一抗4℃孵育PVDF 膜過夜，1∶2 000 稀釋的二抗室溫孵育PVDF 膜1 h，采用ECL 顯影液在凝膠成像系統中曝光得到bcl-2、CCND1、Notch1、β-actin 的蛋白條帶，計算bcl-2、CCND1、Notch1 與β-actin 灰度值的比值作為蛋白表達水平。

1.4 新輔助化療方案及pCR 的判斷

乳腺癌患者接受TE 或TEC 方案新輔助化療。化療兩個周期后，進行磁共振檢查并根據RECIST1.1 標準判斷療效，療效達到穩定（SD）、進展（PD）、完全緩解（CR）的患者進行根治性手術，療效達到部分緩解（PR）繼續行兩個周期TEC方案新輔助化療后進行根治性手術。根治性手術后進行病理檢查，乳腺原發灶和轉移區域淋巴結未找到惡性腫瘤的組織學證據認為獲得pCR。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，計量資料經方差齊性檢驗、符合方差齊性并以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，3 組間比較采用方差分析；miR-34a 預測新輔助化療pCR 采用ROC 曲線分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組與對照組外周血miR-34a表達的比較

與對照組比較，乳腺癌組患者外周血miR-34a的表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 乳腺癌組中不同病理特征患者外周血miR-34a 表達的比較

乳腺癌組中不同年齡、月經狀態患者比較，外周血miR-34a 表達水平的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同T 分期、N 分期、臨床分期、Ki-67 表達、分子分型患者比較，外周血miR-34a 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 乳腺癌組中不同病理特征患者外周血miR-34a 表達的比較（±s）Table 1 Comparison of miR-34a expression in peripheral blood of patients with different pathological characteristics in breast cancer group（±s）

表1 乳腺癌組中不同病理特征患者外周血miR-34a 表達的比較（±s）Table 1 Comparison of miR-34a expression in peripheral blood of patients with different pathological characteristics in breast cancer group（±s）

臨床病理特征年齡月經狀態T 分期N 分期臨床分期Ki-67分子分型分類＜50 歲≥50 歲絕經前絕經后T1-2 T3-4 N0-1 N2-3 IIB III陰性陽性Luminal 型HER2 型三陰型n 61 81 84 58 101 41 109 33 95 47 31 111 63 38 41 miR-34a 0.75±0.22 0.70±0.18 0.74±0.21 0.69±0.19 0.77±0.25 0.60±0.17 0.76±0.24 0.60±0.16 0.77±0.25 0.62±0.15 0.47±0.16 0.79±0.24 0.75±0.24 0.68±0.25 0.46±0.14 t/F 值1.489 1.449 3.991 3.591 3.786 6.993 P 值0.139 0.150 0.000 0.001＜0.001＜0.001 22.342＜0.001

2.3 乳腺癌組中不同miR-34a 表達水平患者乳腺癌病灶內bcl-2、CCND1、Notch1 的比較

計算乳腺癌患者外周血miR-34a 表達的中位數，比較不同miR-34a 表達水平患者乳腺癌病灶內bcl-2、CCND1、Notch1 表達水平的差異可知：miR-34a 表達≥中位數患者乳腺癌病灶內bcl-2、CCND1、Notch1 的表達水平低于miR-34a 表達＜中位數的乳腺癌患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

2.4 乳腺癌組中pCR與非pCR患者外周血miR-34a表達的比較

與乳腺癌組中pCR 患者比較，非pCR 患者外周血miR-34a 的表達水平（0.66±0.16）明顯降低于pCR 患者外周血miR-34a 的水平（0.85±0.17），差異有統計學意義（t=3.660，P＜0.05）。

圖1 乳腺癌組中不同miR-34a 表達水平患者乳腺癌病灶內bcl-2、CCND1、Notch1 的蛋白條帶Figure 1 Protein bands of bcl-2，CCND1，Notch1 in breast cancer lesion of patients with different miR-34a expression level in breast cancer group

表2 乳腺癌組中不同miR-34a 表達水平患者乳腺癌病灶內bcl-2、CCND1、Notch1 的比較（±s）Table 2 Comparison of bcl-2，CCND1，Notch1 expression levels in breast cancer lesion of patients with different miR-34a expression level in breast cancer group（±s）

表2 乳腺癌組中不同miR-34a 表達水平患者乳腺癌病灶內bcl-2、CCND1、Notch1 的比較（±s）Table 2 Comparison of bcl-2，CCND1，Notch1 expression levels in breast cancer lesion of patients with different miR-34a expression level in breast cancer group（±s）

miR-34a 表達水平≥中位數＜中位數t 值P 值n 71 71 Bcl-2 0.67±0.16 1.14±0.32 9.938 0.000 CCND1 0.58±0.12 0.94±0.27 7.582 0.000 Notch1 0.55±0.14 1.22±0.36 13.274 0.000

2.5 miR-34a 預測新輔助化療pCR 的ROC 曲線分析

miR-34a 預測新輔助化療pCR 的ROC 曲線下面積為0.807（95%CI：0.729～0.886，P＜0.05）。根據約登指數最大值確定miR-34a 預測pCR 的最佳截斷值為0.735，靈敏度為82.93%、特異性為69.31%。見圖2。

圖2 miR-34a 預測新輔助化療pCR 的ROC 曲線Figure 2 ROC curve of miR-34a in predicting PCR of neoadjuvant chemotherapy

3 討論

新輔助化療是乳腺癌重要的治療手段，化療后獲得pCR 對改善遠期預后具有積極意義，但目前關于乳腺癌化療敏感性的調控機制尚不十分清楚。近些年，miR 在乳腺癌發病中的作用受到越來越多關注，相關臨床研究發現，乳腺癌組織中存在多種miR 的異常表達［9-10］；相關基礎研究發現，miR對乳腺癌細胞的惡性生物學行為及放化療敏感性具有調控作用［11］。

miR-34a 具有抑癌作用，已有研究報道，乳腺癌、胃癌、結直腸癌、口腔癌等惡性腫瘤中miR-34a的表達減少［7，12-14］。本研究結果與既往國內外學者報道的乳腺癌中miR-34a 低表達結果［7，12］一致。乳腺癌中miR-34a 生物學功能相關的實驗研究發現，miR-34a 對乳腺癌細胞的增殖、侵襲具有抑制作用［8，15］。在乳腺癌病情發展過程中，癌細胞不斷增殖、侵襲能夠造成腫瘤病灶增大、促進腫瘤浸潤及遠處轉移。本研究進一步觀察結果表明miR-34a 低表達與乳腺癌多項病理特征的惡化有關，與之相關的可能機制是miR-34a 表達減少后、相應的抑癌作用減弱，進而促進了乳腺癌的發展。

miR-34a 的抑癌作用與其對多種原癌基因表達的抑制作用有關，李志華［9］的研究發現miR-34a 能夠抑制乳腺癌細胞中bcl-2、CCND1、Notch1 三種基因的表達。bcl-2、CCND1、Notch1 是目前已知具有促增殖作用的原癌基因，在乳腺癌病灶內均呈高表達的趨勢，能夠通過阻礙細胞凋亡、加速細胞周期進程、促進細胞有絲分裂等方式促進細胞增殖。為了進一步闡明miR-34a 在乳腺癌發展中的作用及可能機制，本研究分析結果與miR-34a 在細胞實驗中抑制bcl-2、CCND1、Notch1 表達的作用吻合，表明miR-34a 低表達在乳腺癌發病及病理進程中的作用可能與增加多種原癌基因的表達有關［16］。

本研究結果提示miR-34a 的低表達可能影響新輔助化療效果、與患者未能獲得pCR 有關。ROC曲線分析表明miR-34a 有望成為預測乳腺癌新輔助化療pCR 的標志物。

綜上所述，乳腺癌患者外周血miR-34a表達減少且與病理特征惡化、新輔助化療未能獲得pCR 有關，未來miR-34a 有望成為乳腺癌診療及新輔助化療效果預測的新靶點，但本研究的樣本量相對較小且未對接受新輔助化療的乳腺癌患者進行術后生存的長期隨訪，今后應繼續收集病例并進行生存隨訪，以闡明miR-34a 在乳腺癌發生發展中的作用。