小兒視網膜母細胞瘤VEGF、Cyclin D1及E-Cadherin表達及與組織病理特征的關系

汪嶺 馬雪蓮 王啟明

視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）為兒童發病率較高的一類眼內惡性腫瘤，不僅對患兒視力造成嚴重影響，更危及患兒的生命安全［1］。腫瘤血管新生和細胞外基質降解為腫瘤浸潤轉移過程中的關鍵因素，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）為已知的最強促血管形成因子之一，在惡性腫瘤發生發展中具有重要作用［2］。細胞周期調節蛋白D1（Cell cycle regulatory protein D1，Cyclin D1）參與了細胞周期G1/S 期轉換，與多種腫瘤的發生發展密切相關［3］。上皮鈣黏蛋白（Epithelial cadherin，E-Cadherin）陽性表達具有抑制腫瘤細胞侵襲轉移的功能，并與多種腫瘤腫瘤浸潤、臨床分期及淋巴結轉移密切相關［4］。目前，對于VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 在RB 患兒中聯合檢測的研究尚不多見，RB 患兒腫瘤組織VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達檢測對于RB 患兒的診斷、評估和預后分析可能存在顯著價值。故本研究對RB 患兒VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達及與組織病理特征的關系進行了研究，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2017年1月至2019年1月收集的55例小兒RB 組織樣本，納入標準：①均為單眼發病；②均經病理學檢查確診；③均征得患兒家屬同意并簽署知情同意責任書。排除標準：①合并其他眼部疾病者；②臨床資料缺失者；③依從性差及無法配合完成此研究者；④合并其他嚴重疾病者。患兒年齡為5 個月至8 歲，平均（2.8±0.6）歲，男30例，女25 例，左眼29 例，右眼25 例，分化35 例，未分化25 例；侵犯神經36 例，未侵犯神經24 例；臨床分期眼內生長期7 例、眼內壓增高期28 例、眼外轉移期20 例；病理分期R0 期（腫瘤細胞不呈菊花團狀排列）5 例、R1（僅少數腫瘤細胞呈菊花團狀排列）期27 例、R2 期（多數腫瘤細胞呈菊花團狀排列）23 例。并取55 例患兒瘤旁正常視網膜組織作為對照。本研究取得醫學倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1 臨床病理特征統計

統計所有RB 組織對應患兒的性別、年齡、分化情況、臨床分期、視神經侵犯程度、病理分期等資料。

1.2.2 免疫組織化學法染色

免疫組化染色法檢測VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達，取腫瘤組織及癌旁正常視網膜組織常規石蠟包埋，4 μm 連續切片，常規脫水，抗原修復。加入一抗和二抗，37℃孵育40 min。DAB 顯色30 s，蘇木精復染，封片顯微鏡下觀察。VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 染色結果表現為細胞質或細胞核中染色為棕黃色顆粒。結果判讀［5］：陽性細胞數評分隨機選取5 個高倍鏡視野，視野內陽性細胞數百分比≤5%為陰性（-），6%～25%為弱陽性（+），26%～50%為陽性（++），＞50%為強陽性（+++）。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；Spearman 檢驗分析各指標相關性，Cox 回歸模型分析各指標與RB 患兒預后的關系。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常視網膜組織與RB 組織VEGF、Cyclin D1及E-Cadherin 表達情況比較

免疫組化染色結果顯示，RB組織中VEGF、Cyclin D1 表達陽性率均顯著高于正常視網膜組織（高表達），E-Cadherin 表達顯著低于正常視網膜組織（低表達），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1和表1。

圖1 RB 組織VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達免疫組化染色（SP，×200）Figure 1 Immunohistochemical staining of VEGF，Cyclin D1 and E-Cadherin expression in RB tissue（SP，×200）

表1 正常視網膜組織與RB 組織VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of VEGF，Cyclin D1 and E-Cadherin expression between normal retinal tissue and RB tissue［n（%）］

2.2 RB 組織VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達相關性分析

VEGF、Cyclin D1 之間存在正相關性，差異有統計學意義（P＜0.05），VEGF、Cyclin D1 均與E-Cadherin 之間存在負相關性，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 RB 組織VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達相關性分析Table 2 Correlation analysis of VEGF，Cyclin D1 and E-Cadherin expression in RB tissue

2.3 RB 患兒VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達與組織病理特征的關系

RB 患兒不同性別、年齡、眼別VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同分化情況、臨床分期、病理分期、視神經侵犯程度RB 患兒VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 Cox 回歸多因素生存分析

臨床分期越高、神經侵犯程度越高、VEGF、Cyclin D1 陽性高表達及E-Cadherin 低表達陽性為影響患者生存的不良因素（P＜0.05）。見表4。

3 討論

RB 具有生長速度快、惡性程度高的特點，主要來源于光感受器前體細胞，多具有一定的家族遺傳傾向，容易發生顱內及遠處轉移，危及患兒生命［6］。視網膜母細胞瘤多表現為結膜內水腫、充血、角膜水腫、玻璃體混濁、虹膜新生血管、眼壓升高及斜視等，但其具體的機制目前尚未完全明確［7］。研究認為［8］，原癌基因和抑癌基因表達平衡失調及轉錄調控異常為腫瘤發生、發展的分子機制。

本研究結果提示VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 在RB 病理進程中具有重要作用。視網膜母細胞瘤與多數實體瘤一樣，腫瘤發生發展需要通過血管、淋巴管向遠處轉移，也需要新生血管形成二維腫瘤組織提供充足的營養物質。VEGF 為強促血管生成因子，也是腫瘤血管新生的主要促進因子，是多種實體瘤發生發展的關鍵因子［9］。Cyclin D1 為反映細胞周期變化的蛋白，為細胞周期的正向調控因子，Cyclin D1 表達異常上調可導致組織細胞無序性生長增加，從而導致腫瘤的發生。近年來，對于Cyclin D1 在腫瘤發生發展中的作用受到廣泛重視，在多種惡性腫瘤組織中都檢測到Cyclin D1 的過度表達［10］。本研究中，在RB 組織中Cyclin D1 表達相較于癌旁正常視網膜組織表達陽性率明顯升高。研究表明，Cyclin D1 在食管癌、前列腺癌等疾病過程中發揮重要作用，并與分化程度、組織學類型等密切相關［11-12］。

表3 RB 患兒VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達與組織病理特征的關系［n（%）］Table 3 The relationship between the expression of VEGF，Cyclin D1 and E-Cadherin and histopathological characteristics in children with RB［n（%）］

表4 Cox 回歸多因素生存分析Table 4 Cox regression multivariate survival analysis

E-Cadherin 為膜整合糖蛋白家族的一類，為鈣離子依賴性正常細胞-細胞黏附的主要介質。研究證實［13-14］，E-Cadherin 低表達可促進癌細胞侵襲、分化和轉移，是機體重要的抗腫瘤侵襲分子之一。另有研究指出［15］，E-Cadherin 表達水平與宮頸癌的侵犯血管、病理分期等密切相關，E-Cadherin表達越低，腫瘤侵襲更深，遠處轉移更廣。本研究結果顯示，VEGF、Cyclin D1 之間存在正相關性，VEGF、Cyclin D1 分別與E-Cadherin 存在負相關性，但其具體機制仍有待進一步研究。本研究推測：RB 惡性程度越高，腫瘤新生血管也更加豐富，其生長也更加迅速，誘導新生血管形成的能力提高，促使VEGF 和Cyclin D1 升高，隨著腫瘤發展，機體抗腫瘤能力逐漸降低，E-Cadherin 表達也隨之降低。這提示VEGF、Cyclin D1 表達越高及E-Cadherin 表達越低，RB 患兒預后越差；VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 可作為RB 患兒預后評估的有效監測指標。在接下來的研究中，本研究將著重針對VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 影響RB 發生發展及三指標之間存在的相互關系的分子生物學機制進行研究，以為RB患兒的臨床診療和預后評估提供參考。

綜上所述，VEGF、Cyclin D1 陽性表達越高、E-Cadherin 陽性表達越低，小兒RB 腫瘤惡性程度越高、預后越差，檢測VEGF、Cyclin D1 及E-Cadherin 表達有助于RB 患兒病情評估。