胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（探針雜交法）的評價

張文新 于婷 賈崢 孫楠 孫晶 黃杰 曲守方

染色體數目異常和結構異常導致新生兒出生缺陷，其中21 三體、18 三體、13 三體是臨床上最常見的染色體疾病［1-2］。目前21 三體、18 三體和13 三體的檢測方法主要有血清學篩查、無創產前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）［3-4］、細胞核型分析和單核苷酸多態性微陣列（single nucleotide polymorphism microarray，SNP-array）等分子生物學方法［5-6］，其中基于高通量測序平臺的NIPT 技術目前已被廣泛應用于胎兒染色體非整倍體產前篩查。

隨著分子生物學技術在臨床檢測領域的發展，基于不同平臺的胎兒染色體非整倍體檢測技術方法不斷涌現。胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（探針雜交法）是通過特異性探針捕獲21 號、18 號、13 號及Y 染色體上的目標片段，捕獲后的片段與設計好的核酸骨架結構連接成環，對DNA 環進行恒溫滾環擴增延長，對延長的多拷貝DNA 進行染色體特異的熒光標記，在顯微成像設備上只針對21 號、13 號和18 號染色體上的DNA片段進行計數分析，評估胎兒患T21、T18 或T13 綜合征的風險［7］。中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）研制的基于SNP 檢測方法的胎兒染色體非整倍體（21 三體、18 三體和13 三體）國家參考品，可以用于該技術方法試劑盒的評價。本研究通過應用該探針雜交法試劑盒對國家參考品進行檢測，以評價該技術方法試劑盒的檢測性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 國家參考品

基于單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測方法的胎兒染色體非整倍體（21 三體、18 三體和13 三體）國家參考品，包括3 份正常人樣本，72 份模擬胎兒游離DNA 不同比例的21 號、18 號、13 號染色體非整倍體異常樣本，9 份微缺失微重復樣本和20 份其他染色體非整倍體異常的樣本，中檢院提供。

1.1.2 試劑

胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（探針雜交法），全自動核酸處理系統（Easy Core）和全自動熒光顯微成像分析儀（Easy View），蘇州新波生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 血漿游離DNA 提取

采用試劑盒說明書指定的游離DNA 提取試劑盒（磁珠法）和全自動核酸提取儀對國家參考品血漿樣本和陰、陽性質控品進行游離DNA 提取和純化。

1.2.2 游離DNA 的處理

將帶有游離DNA 的洗脫板放入到Easy Core儀器，打開Easy Core 軟件登錄進入操作界面，點擊“滾環擴增”進入樣本選擇界面，選擇樣本（提取后的洗脫板）。確認試劑和耗材擺放，然后運行儀器。經過內切酶剪切游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）、探針捕獲cfDNA 片段后與骨架DNA 連接成環、消化殘余單鏈線性DNA、滾環擴增延長cfDNA 片段和染色體特異熒光標記等步驟，轉移產物至檢測板，運行結束后把檢測板小心取出。

1.2.3 信號讀取

將檢測板小心放入Easy View 托盤上，注意A1 孔朝左上方（條形碼在右側），運行Easy View儀器。掃描檢測板條形碼，隨后儀器進行自檢，自檢通過后開始信號讀取。儀器對檢測板每一個孔位的121 個區域進行拍照，每個區域在每個熒光通道拍1 張照片，包括chr21、chr13、chr18、chrY 共4個檢測通道。每個孔位拍照結束后會根據總的熒光點數（counts）和所拍區域的數量計算出該孔位熒光點的密度（density）。

1.2.4 結果分析

使用無創產前篩查風險分析軟件，從每份樣本拍照計數得到的21 號、18 號和13 號染色體的熒光信號（density）計算三者之間的相對比例（raw_ratio），再通過Levenberg-Marquardt 進行回歸分析得到三者校正后的比例（Norm_ratio），計算Z 值，評估樣本的21 號、18 號和13 號染色體三體的風險。

2 結果

2.1 國家陽性參考品、陰性參考品及T18 微重復參考品結果

取三批試劑盒，每批試劑重復檢測3 套相同的國家參考品。在9 次測試中，國家參考品中15 例10%胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）比例的T21 陽性參考品和32 例陰性參考品的結果表明，T21 陽性參考品均檢出T21 高風險（high risk），陰性參考品均未出現T21 高風險或T21 灰區（grey zone）。國家參考品中6 例10%胎兒游離DNA 比例的T18 陽性參考品、2 例T18 微重復參考品和32 例陰性參考品的結果表明，T18 陽性參考品均檢出T18 高風險，chr18 微重復參考品97-Rep-Dup-5 和100-Rep-Dup-8 檢出T18 高風險，陰性參考品均未出現T18 高風險或T18 灰區。國家參考品中3 例10%胎兒游離DNA 比例的T13 陽性參考品和32 例陰性參考品的結果表明，T13 陽性參考品均檢出T13 高風險，陰性參考品均未出現T13 高風險或T13 灰區。見圖1。

圖1 10%cffDNA 比例國家參考品結果Figure 1 The results of national reference materials with 10%cffDNA fraction

2.2 國家檢測限參考品結果

對于國家檢測限參考品，24 例5%胎兒游離DNA 比例檢測限參考品在9 次測試中均正確檢出，而24 例3.5%胎兒游離DNA 比例檢測限參考品在9 次測試中的正確檢出率分別為75%～92%。第一批次試劑盒對24 例5%檢測限參考品和24 例3.5%檢測限參考品共48 例樣本的3 次重復檢測結果，見表1，三批試劑盒對24 例5%檢測限參考品和24 例3.5%檢測限參考品的檢出率統計結果。見表2、表3。

3 討論

1997年，香港中文大學盧煜明教授發現孕婦外周血游離DNA 中存在胎兒成分［7］，基于這一研究，無創產前基因檢測（Noninvasive prenatal genetic testing，NIPT）技術為胎兒染色體非整倍體檢測開辟新的方向，同時隨著高通量測序技術的發展，21 三體、18 三體、13 三體的NIPT 技術逐漸成熟并在產前篩查中廣泛應用。目前，21 三體、18 三體、13 三體的NIPT 技術多采用以全基因組低深度測序的高通量測序策略，國家藥監局現已批準的NIPT 產品也均采用該方法學，該方法學在樣本建庫過程中不對來自不同染色體的DNA 序列加以區分，而是通過后續生物信息學分析識別其原始位置并通過分析每條染色體上檢測到的堿基占所有檢測到堿基的百分比來對染色體是否存在非整倍體進行判斷。

隨著分子診斷技術在臨床應用上的發展，也出現了NIPT 技術應用的不同平臺。Vanadis NIPT系統即可用于胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體的檢測，它包括Easy Extrac、Easy Core和Easy View 等三臺設備和配套的專用圖像分析軟件以及胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（探針雜交法）。該試劑盒針對21 號、18號、13 號及Y 染色體各設計3 000 個探針，其結果分析基于正常樣本群得出回歸曲線，所以對每次測試中陰性樣本的數目有要求。另外分析方法對每次測試中陽性樣本所占的比例也有一定的規定，一般不應超過15%［8］。與高通量測序法相比，探針雜交法不對全部染色體核酸片段進行分析，

只針對21 號、18 號和13 號染色體上的DNA 片段，通過專用圖像軟件對來自不同熒光DNA 微球進行計數分析，因此不用通過生物信息分析具體的序列信息。同時由于該方法在捕獲cfDNA 片段后，僅通過滾環擴增延長DNA 片段而不進行擴增，可減少PCR 擴增效率不同帶來的偏移，且可降低體系污染的風險和可能性。

表1 國家檢測限參考品結果Table 1 The result of national limited reference material

表2 5%胎兒游離DNA 比例檢測限參考品的檢出率結果Table 2 The detection rate of the limited reference with 5%cffDNA fraction

基于SNP 檢測方法的胎兒染色體非整倍體（21 三體、18 三體和13 三體）國家參考品，包括染色體非整倍體、微缺失微重復和正常樣本，適用于單核苷酸多態性（SNP）位點基因芯片法和基于SNP 位點的高通量測序法等。人群中胎兒DNA濃度分布的統計結果表明有接近一半樣本中胎兒游離DNA 比例大于10%，超過96%樣本中胎兒游離DNA 比例高于4%［9-10］。而胎兒游離DNA 比例是NIPT 技術準確度的主要因素，低胎兒游離DNA比例會導致假陰性結果的較高風險［8］。而國家檢測限參考品要求5%胎兒游離DNA 比例檢測限參考品檢出率應不低于90%，3.5%胎兒游離DNA 比例檢測限參考品檢出率應不低于50%［9］。

三批試劑盒對國家參考品中104 例樣本進行檢測，結果均符合國家參考品的預期結果。9 次測試中，5%胎兒游離DNA 比例檢測限參考品檢出率均為100%，3.5%胎兒游離DNA 比例檢測限參考品檢出率最低為75%，最高可達到92%；微缺失微重復參考品中18 號染色體微重復的參考品均為18 三體。由此可見，該探針雜交法的試劑盒即使在低胎兒游離DNA 比例的情況下也能實現胎兒染色體非整倍體的較高檢出率，保證胎兒染色體非整倍體的較準確檢出。

應用基于SNP 檢測方法的胎兒染色體非整倍體（21 三體、18 三體和13 三體）國家參考品對該探針雜交技術檢測試劑盒進行評價，結果顯示其陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、檢測限和重復性均符合我國國家參考品的相關規定，性能均可到達我國國家參考品的要求。