尿素包合法富集核桃油不飽和脂肪酸工藝優化

李泉岑 龍勇益 夷娜 王瓊瓊 王磊 李勝 白冰瑤 張麗

摘 要：本試驗以新疆薄皮核桃油為原料，采用正交試驗優化核桃油混合脂肪酸的皂化工藝及響應面法優化尿素包合法富集不飽和脂肪酸的工藝。得到核桃油混合脂肪酸皂化工藝的最優方案為皂化液濃度1 mol·L-1、皂化溫度80 ℃、皂化時間4.5 h，在此條件下混合脂肪酸得率為75.58%;尿素包合法富集不飽和脂肪酸的最優工藝為包合時間20 h、包合溫度-18 ℃、醇脲比5∶1、脲脂比2∶1，在此條件下不飽和脂肪酸得率為55.26%。

關鍵詞：核桃油;尿素包合;不飽和脂肪酸

Abstract：In this experiment， the Xinjiang walnut oil as raw material， the saponification process of walnut oil mixed fatty acid was optimized by orthogonal test and response surface method was used to optimize the urea inclusion process of unsaturated fatty acids. The optimal scheme of the walnut oil mixed fatty acid saponification process is the concentration of the saponification solution was 1 mol·L-1， the saponification temperature was 80 ℃， and the saponification time was 4.5 h.

Under these conditions， the yield of mixed fatty acids was 75.58%. The optimal process for enriching unsaturated fatty acids by urea inclusion method is rates of urea and fatty acid was 2∶1， the rates of alcohol and urea was 5∶1， the inclusion temperature was -18 ℃， the inclusion time was 20 h. Under these conditions， the yield of unsaturated fatty acids was 55.26%.

Key words：Walnut oil; Urea inclusion; Unsaturated fatty acids

中圖分類號：TQ645.6

核桃油中含有大量人體所必需的不飽和脂肪酸[1-3]，

如亞油酸，亞麻酸等。不飽和脂肪酸可以有效降低人體的血壓和血脂[4]、降低血清中膽固醇的含量、抗炎[5]、延緩衰老過程、預防疾病[6]、增進血液流通、預防動脈粥樣硬化[7]、加速新陳代謝，并且對過敏反應也有一定的抑制作用[8]，具有重要的生理功能[9-10]。核桃油營養價值高，原材料易獲得，且不飽和脂肪酸在保健品以及醫藥品中的重要作用逐漸顯露出來，因此具有巨大的發展潛力。

不飽和脂肪酸富集方法有很多種[11-15]，其中尿素包合法因操作簡單、成本較低、便于工業化生產等優點被廣泛應用[16-18]。本實驗以新疆薄皮核桃油選定為研究對象，富集方法選用尿素包合法，通過研究各因素對尿素包合效果影響的規律，找出最優提取工藝方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

新疆薄皮核桃油（實驗室壓榨法制取）;氫氧化鈉、尿素、甲醇、無水硫酸鈉、95%乙醇、石油醚（30～60 ℃）、

氯化氫、氯化鈉，以上試劑均為分析純。

SHZ-19 B循環水真空泵，天津市華興科學儀器廠生產;RE-3000A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠生產;SG260E1榨油機，浙江蘇泊爾股份有限公司生產;PHS-3E pH計，上海儀電科學儀器有限公司生產;LE-203E電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產;DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器廠生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備

根據吳麗雅等的方法，稱取10 g核桃油，緩慢加入到一定濃度的氫氧化鈉乙醇溶液中加熱回流，回流過程中加入蒸餾水，使皂化液充分溶解，將溶液移入分液漏斗，加入石油醚萃取，使醚層和水層分離，分離出的水層加入鹽酸調節pH值至1～2，再次移入分液漏斗加入石油醚萃取，得到油層，加蒸餾水沖洗至中性，加入無水硫酸鈉干燥過濾，用旋轉蒸發儀旋蒸獲得混合脂肪酸[19]。

1.2.2 不飽和脂肪酸的富集

根據劉旭等的方法，按一定比例將尿素和乙醇混合，加熱回流至溶解后加入混合脂肪酸，繼續加熱一定時間后冷卻，密封放入冰箱冷凍結晶，結晶后取出結晶物抽濾，濾液加蒸餾水多次洗滌，旋蒸除去乙醇，用鹽酸調節pH至2～3，加入石油醚萃取出上層液，加蒸餾水于上層液調節至中性，用無水硫酸鈉干燥過濾，旋蒸后得到不飽和脂肪酸[20]。

1.2.3 不飽和脂肪酸得率的計算

1.3 數據處理與統計分析

數據分析采用IBM SPSS Statistics 26進行方差分析，采用0.05水平。

2 結果與分析

2.1 皂化實驗提取混合脂肪酸

2.1.1 單因素試驗

（1）皂化液濃度對混合脂肪酸得率的影響。在皂化溫度80 ℃、皂化時間5 h條件下，分別設置不同皂化溶液濃度，混合脂肪酸得率隨皂化液濃度的變化如圖1所示。

由圖1可知，當皂化液濃度小于1 mol·L-1時，皂化液濃度增高，脂肪酸得率上升，當濃度高于1 mol·L-1

時，脂肪酸得率緩慢下降。這是因為皂化液可以促進皂化反應正向進行，當皂化液濃度高于1 mol·L-1時，會使溶液堿性增強，后面加入鹽酸調pH時，由于溶液堿性太強，加入鹽酸量會相應增大，可能會造成混合脂肪酸的損耗率增高，從而使混合脂肪酸得率

下降。

（2）皂化溫度對混合脂肪酸得率的影響。在皂化時間5 h、皂化溶液濃度1 mol·L-1條件下，分別設置不同皂化溫度，混合脂肪酸得率隨皂化溫度的變化如圖2所示。

由圖2可知，溫度在80 ℃時，混合脂肪酸得率最高。隨著溫度升高，反應正向進行;當溫度高于80 ℃

時，可能會發生其他的一些副反應，導致混合脂肪酸得率會降低。因此，皂化溫度在80 ℃時混合脂肪酸得率最高。

（3）皂化時間對混合脂肪酸得率的影響。在皂化溫度80 ℃、皂化溶液濃度1 mol·L-1條件下，分別設置不同皂化時間，混合脂肪酸得率隨皂化時間的變化如圖3所示。

由圖3可知，皂化時間在5 h時，混合脂肪酸得率最高。當皂化時間高于5 h，得率下降。原因可能是開始反應時核桃油中的脂類物質與皂化液充分接觸，使得脂類物質充分水解，當時間高于5 h，水解反應達到了一定的程度，繼續反應將會使生成的皂化物逆向反應發生分解，使混合脂肪酸得率下降。所以最佳皂化時間為5 h。

2.1.2 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上，運用軟件正交設計助手Ⅱ3.1中的L9（34）正交表，選取皂化液濃度（A）、皂化時間（B）、皂化溫度（C）3個因素進行考察，選取混合脂肪酸得率為考察指標，確定混合脂肪酸的提取工藝的最優方案。皂化工藝的正交試驗水平見表1，皂化工藝的正交試驗結果見表2。

由表2可以看出，各因素對混合脂肪酸得率的影響從大到小依次為A>C>B，含量最優組合為A2B1C2，即混合脂肪酸得率的最優方案為皂化液濃度1 mol·L-1、皂化溫度80 ℃、皂化時間4.5 h。此條件下，混合脂肪酸的率最高。

2.1.3 驗證試驗

通過上述正交實驗得到的最優方案進行3次試驗，得到混合脂肪酸得率為75.58%，高于正交實驗中的最好實驗4號得率75.03%，進一步確證了皂化工藝的最優條件。

2.2 尿素包合實驗提取不飽和脂肪酸

2.2.1 單因素實驗

（1）包合時間對不飽和脂肪酸得率的影響。在脲脂比（尿素與混合脂肪酸的比值）為2∶1、醇脲比（乙醇與尿素的比值）為5∶1、包合溫度-18 ℃的條件下，考察不同包合時間對不飽和脂肪酸得率的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，包合時間在20 h時，不飽和脂肪酸得率最高，高于20 h，得率下降。原因可能是包合時間少于20 h時，包合未達到飽和狀態;反應進行到

20 h后，體系中的飽和脂肪酸被包合完全，繼續反應，尿素可能包合不飽和脂肪酸，導致不飽和脂肪酸得率降低。所以，當包合時間在20 h時不飽和脂肪酸得率最高。

（2）包合溫度對不飽和脂肪酸得率的影響。在脲脂比為2∶1、醇脲比為5∶1、包合時間20 h的條件下，分別設置不同包合溫度，考察包合溫度對不飽和脂肪酸得率的影響，結果如圖5所示。

由圖5可知，包合過程中溫度太低，包合反應體系在還未包合完全的情況下就已經凝結，導致不飽和脂肪酸得率低。當溫度超過-18 ℃后，溫度升高會使尿素晶體的結晶量減少，不利于尿素結晶，且晶體的穩定性會變差導致不飽和脂肪酸得率降低。由此得出，在-18 ℃時，不飽和脂肪酸得率最高。

（3）醇脲比對不飽和脂肪酸得率的影響。在脲脂比為2∶1、包合溫度-18 ℃、包合時間20 h的條件下，分別設置不同醇脲比，不飽和脂肪酸得率隨醇脲比的變化如圖6所示。

由圖6可知，當醇脲比為5∶1時得率最高。這是由于乙醇用量太少時，尿素不能溶解充分，反應相中尿素濃度太高，不利于包和反應的正向進行，還有可能是當尿素包合完全混合脂肪酸的飽和脂肪酸后，會繼續包合不飽和脂肪酸，導致不飽和脂肪酸的得率降低;當乙醇用量太多，尿素濃度太低，也不利于包合反應的進行。綜合考慮，當醇脲比為5∶1時，不飽和脂肪酸得率最高。

（4）脲脂比對不飽和脂肪酸得率的影響。在醇脲比為5∶1、包合溫度-18 ℃、包合時間20 h的條件下，分別設置不同脲脂比，不飽和脂肪酸得率隨脲脂比的變化如圖7所示。

由圖7可知，當脲脂比為2∶1時得率最高。這是由于當尿素用量太大時，尿素包合完全混合脂肪酸中的飽和脂肪酸后，會繼續包合不飽和脂肪酸，導致不飽和脂肪酸的得率降低，在脲脂比未達2：1時，由于尿素用量太少，會導致混合脂肪酸中的飽和脂肪酸未被包合完全，從而使得不飽和脂肪酸得率降低。

2.2.2 響應面試驗

（1）響應面發優化提取工藝模型建立與分析。根據單因素試驗結果，選取包合時間、包合溫度、醇脲比、脲脂比為試驗因素，評價指標為不飽和脂肪酸得率，使用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-behnken進行響應面設計。尿素包合反應響應面試驗因素水平見表3，尿素包合反應響應面設計方案及結果見表4，尿素包合反應回歸方程方差分析見表5。

通過回歸分析，得到各因素與不飽和脂肪酸得率的方程式為：

不飽和脂肪酸得率=55.11+1.40A-1.87B+2.01C+

1.90D-0.19AB+0.25AC-0.024AD+0.037BC+0.094BD-0.005CD-2.26A2-2.95B2-3.15C2-4.42D2。

根據表5得知，A、B、C、D以及A2、B2、C2、D2對不飽和脂肪酸得率的影響極顯著，而交互項對其影響不顯著（P>0.05）。由于其失擬項P值為0.406 2，不顯著，可知該模型擬合度較好;決定系數R2和RAdj2分別為0.995 8和0.991 6，表明預測值和真實值之間有較高的相關性。由此可知，該模型可以反映不飽和脂肪酸得率的真實情況。根據F值可知，影響不飽和脂肪酸得率的各因素大小排序為：醇脲比>脲脂比>包合溫度>包合時間。

（2）最佳提取工藝試驗及驗證。根據Design-Expert8.0.6給出的回歸方程，得出包合時間20.68 h、包合溫度-18.65 ℃、醇脲比5.33∶1、脲脂比2.11∶1為該試驗的最優提取工藝，在此條件下，得出不飽和脂肪酸最高的率為56.18%。根據實際情況，采取包合時間20 h，包合溫度-18 ℃，醇脲比5∶1，脲脂比2∶1的條件，重復3次試驗，得出不飽和脂肪酸得率為55.26%±0.5%，與理論值（54.99%）較為接近，說明響應面法優化核桃油不飽和脂肪酸的方法較為合理，具有可行性。

3 結論

本研究以新疆薄皮核桃油為原料，運用尿素包合法對核桃油中不飽和脂肪酸進行富集，通過正交實驗得出在皂化液濃度為1 mol·L-1，皂化溫度為80 ℃，皂化時間為4.5 h的條件下，混合脂肪酸得率為75.58%，該工藝為核桃油混合脂肪酸皂化工藝的最優方案;通過響應面法得出在包合時間20 h，包合溫度-18 ℃，醇脲比5∶1，脲脂比2∶1的條件下不飽和脂肪酸得率為55.26%，該工藝為尿素包合核桃油不飽和脂肪酸的最優方案。該工藝使用成本較低，設備簡單，為日后核桃油不飽和脂肪酸富集的工業化生產奠定了一定的基礎。

參考文獻：

[1]李俊南，習學良，熊新武，等.核桃的營養保健功能及功能成分研究進展[J].中國食物與營養，2018，24（5）：60-64.

[2]常曉虹，田箏，屈直言，等.核桃功效的研究進展[J].現代食品，2020（14）：23-26.

[3]張亭，杜倩，李勇.核桃的營養成分及其保健功能的研究進展[J].中國食物與營養，2018，24（7）：64-69.

[4]馬方，楊宜婷，陳則華.不同類型n-3多不飽和脂肪酸對心血管疾病的防治作用及其機制研究進展[J].中國油脂，2018，43（2）：65-69.

[5]孫桂菊，柳和春，許登峰，等.n-3多不飽和脂肪酸的抗炎作用和2型糖尿病[J].健康教育與健康促進，2020，15（2）：116-119.

[6]李峰，薛長勇.中鏈脂肪酸和α-亞麻酸輔助治療阿爾茨海默病的研究進展[J].中國食物與營養，2018，24（5）：78-82.

[7]趙銀嬌，姚柳，張栩，等.Omega-3多不飽和脂肪酸代謝產物的動脈粥樣硬化拮抗機制[J].中國動脈硬化雜志，2020，28（6）：461-467.

[8]陶鋆，蔡莉.生命早期多不飽和脂肪酸攝入對兒童過敏性疾病的影響研究進展[J].中華疾病控制雜志，2017，21（1）：94-98.

[9]陸文霞，郭傳勇.ω-3多不飽和脂肪酸治療非酒精性脂肪性肝病的研究進展[J].世界臨床藥物，2020，41（2）：94-97，142.

[10] 楊敏，魏冰，孟橘，等.ω-3多不飽和脂肪酸的來源及生理功能研究進展[J].中國油脂，2019，44（10）：110-115.

[11]盧文龍，齊玉堂，韓立娟，等.二次冷凍結晶富集生物柴油中不飽和脂肪酸甲酯[J].武漢輕工大學學報，2017，36（3）：23-26.

[12]Mudgal S，Ran-ressler R R，Liu L，et al.

Branched chain fatty acids concentrate prepared from butter oil via urea adduction[J].Eur J Lipid Sci Technol，2016，118（4）：669-674.

[13]程瑾，李瀾鵬，羅中，等.脂肪酸分離技術研究進展[J].中國油脂，2018，43（11）：49-53.

[14]黃杰秋，朱秋勁，王競，等.分子蒸餾富集蘇麻油中α-亞麻酸的研究[J].食品科技，2016，41（9）：197-202.

[15]王心怡，蔣元，王峰，等.超臨界CO2萃取亞麻籽中α-亞麻酸的工藝研究[J].化工時刊，2016，30（3）：5-8.

[16]孫文菊，武瑞霞，陳楊揚，等.尿素包合法富集魚油中EPA和DHA的研究[J].食品工業，2016（10）：37-40.

[17]王培燕，黃元波.尿素包合法分離混合脂肪酸研究進展[J].綠色科技，2017（20）：186-189.

[18]南陽，張華，劉國琴.尿素包埋法富集椰子油中月桂酸甲酯[J].中國油脂，2016，41（3）：26-29.

[19]吳麗雅，黃群，余佶，等.杜仲籽油混合脂肪酸制備工藝優化及脂肪酸組成分析[J].食品工業科技，2013，34（14）：287-291.

[20]劉旭，張秀玲，趙天彤，等.尿素包合法提純紫蘇籽油中α-亞麻酸工藝的優化[J].食品工業，2016，37（3）：152-156.