蝦青素通過抗氧化作用改善血管性癡呆小鼠學習記憶能力

劉翀，朱寧偉，蔣曉梅

(1.浙江省麗水市中心醫院藥學部，麗水 323000；2.浙江省醫藥高等專科學校藥學系，寧波 315100)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是老年期癡呆的常見類型之一，是由于腦組織長期處于各種缺血缺氧性損傷導致的獲得性智能障礙綜合征[1]。隨著全球人口的老齡化，血管性癡呆患病率呈指數上升，給個人、家庭和社會都帶來負擔。因此，尋找治療和預防血管性癡呆藥物具有重要醫學價值和社會意義。蝦青素是目前抗氧化能力較強的天然藥物，且能通過血腦屏障，其強大的抗氧化能力對神經系統具有保護作用[2]。目前蝦青素在缺血-再灌注等缺血模型中作用有大量的研究，而在血管性癡呆模型研究較少，本實驗通過永久性結扎右側頸總動脈建立小鼠血管性癡呆模型，研究蝦青素對血管性癡呆模型小鼠的學習記憶能力的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 2～3個月齡健康雄性ICR清潔級小鼠60只，體質量(30±5)g，由浙江實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(浙)2014-0001。實驗期間所有動物晝夜室溫控制在約22 ℃，明暗各12 h交替，均予標準飼料喂養。

1.2藥品與試劑 蝦青素(寧波博奧科學儀器有限公司，批號：20180326，含量≥98%)，超氧化物歧化酶 (SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所(批號分別為：S0103，S0131)，ROS熒光探針-DHE購自碧云天生物技術研究所(ROS熒光探針批號：S0063)。

1.3儀器與設備 Morris水迷宮系統(中國成都泰盟科技有限公司，型號：WMT-100S)，石蠟切片機(Leica公司，型號：RM2235型)，CO2培養箱(中國力康發展有限公司，型號：HF160W型)，共聚焦激光掃描顯微鏡(德國Leica公司，型號：SP5型)，酶標儀(美國Thermo Fisher，型號：Multiskan)。

1.4血管性癡呆動物模型的建立及實驗分組 采用永久性結扎右側頸總動脈法制作模型。用4%水合氯醛[1 mL·(10 g)-1]腹腔注射麻醉小鼠，從小鼠頸部正中切口，沿胸鎖乳突肌內側緣分離出肌肉及筋膜，統一將右側頸總動脈與迷走神經輕輕剝離后進行兩端結扎，結扎結束后剪斷頸總動脈，左側頸總動脈不做處理，縫合切口，術后于傷口處撒少量青霉素粉末(每瓶80萬U)。假手術組除不結扎及切斷右側頸總動脈外，其余操作與手術組相同。將手術組存活小鼠采用隨機數字表法分成模型對照組、蝦青素(50，100和200 mg·kg-1)4個組，每組11只。手術過程中5只死亡，死亡率為8%。另設假手術組11只。

1.5蝦青素溶液的配制及給藥方法配制 3組劑量蝦青素標準液：稱量蝦青素于15 mL離心管中，加入為0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，最終配制成蝦青素標準液。超聲混懸20 min，現配現用。灌胃給藥：小鼠手術休息5 d后開始灌胃給藥。根據小鼠體質量分別給予50，100，200 mg·kg-1蝦青素，假手術組和模型對照組給予羧甲基纖維素鈉溶液，所有小鼠均按0.1 mL·kg-1每天灌胃1次，持續給藥1個月。

1.6Morris水迷宮行為學 觀察所有小鼠灌胃給藥1個月后，進行Morris水迷宮定位航行實驗，實驗過程中實驗室保持光線昏暗及周圍環境安靜狀態。將水池平分為4個象限，將平臺放置在1個象限的固定地方，令水面高出平臺2 cm，水溫保持在(24±2) ℃。將各組小鼠從同一象限放入水中，錄像記錄大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)，若大鼠在60 s內找不到平臺，實將其放上平臺并保持10 s，將其從平臺上取下休息20 s后，依次進入下一象限實驗。若小鼠在60 s內找到平臺，令其在平臺上休息10 s后取下，其余操作同前，持續5 d重復實驗。通過實驗視頻分析軟件導出數據，分析平均速度和平均逃避潛伏期。

1.7強迫游泳實驗 所有小鼠灌胃干預1個月后，進行強迫游泳實驗。第1天將小鼠置于游泳桶中游泳 15 min進行，游泳桶尺寸為15 cm×25 cm，取出后烘干，歸籠。第2天，在同樣的條件下進行強迫游泳6 min，記錄后4 min在水中靜止不動時間。靜止不動的標準為小鼠只將頭部露出水面漂浮于水面，除了避免沒入水中而向上的主動運動外，無其他行為，不動時間越長，表明動物越絕望。

1.8Nissl染色 水迷宮實驗和強迫游泳實驗結束處死小鼠，取部分腦組織置于4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋、切片后制作成切片厚度5 μm，按Nissl染色試劑盒標準步驟進行實驗，剩余腦組織-20 ℃保存備用用于后續實驗檢測。

1.9SOD和MDA檢測 取各組小鼠海馬組織，按每10 mg加入SOD樣品制備液100 μL，比例在4 ℃或冰浴進行勻漿。隨后在4 ℃離心機12 000×g離心3～5 min，取上清液作為待測樣品。按照BAC試劑盒步驟測定樣本蛋白濃度。然后根據SOD和MDA檢測按照試劑盒說明書步驟測定樣品中SOD活力和MDA含量。

1.10活組織ROS熒光探針-DHE染色 小鼠麻醉后迅速處死取腦，沿海馬槽走向連續冠狀面切片，切片厚度400 μm。將腦片放入持續通入混合氧氣的人工腦脊液中靜置15 min后，隨后按照試劑盒說明書進行染色，染料濃度5 nmol·L-1，CO2培養箱中孵育30 min，孵育結束后立即置于共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1平均速度 各組小鼠平均運動速度均隨著訓練天數增加而降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，各組內每日平均運動速度差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)，說明小鼠運動能力無差異，排除因小鼠的運動能力影響尋找平臺時間。

2.2平均逃避潛伏期 各組小鼠5 d的逃避潛伏期時間見圖2，假手術組平均逃避潛伏期時間隨著實驗時間的增加而縮短。模型對照組平均逃避潛伏期在第3天有所下降，5 d的平均逃避潛伏期時間均高于假手術組。蝦青素組小鼠平均逃避潛伏期時間均隨著訓練天數增加而縮短，蝦青素組200 mg·kg-1在第4和第5天的平均逃避潛伏期時間較模型對照組顯著下降(P<0.05)與假手術組走勢相似；蝦青素50，100 mg·kg-1兩組小鼠平均逃避潛伏期與模型對照組相比差異無統計學意義。

圖1 5組小鼠平均運動速度

2.3強迫游泳時間強迫游泳實驗結果 如圖3所示，與假手術組相比，模型對照組(P<0.01)、蝦青素組50 mg·kg-1(P<0.05)及100 mg·kg-1(P<0.05)在水中靜止不動的時間顯著延長。相比于模型對照組，應用蝦青素組小鼠的水中靜止時間均有所下降，其中應用蝦青素組200 mg·kg-1水中靜止不動的時間與模型對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

①與模型對照組比較，P<0.05。

①與模型對照組比較，P<0.01；②與假手術組比較，P<0.05；③與假手術組比較，P<0.01。

2.4Nissl染色Nissl染色結果 見圖4，模型對照組小鼠神經元結構出現明顯破壞，尤其在CA1和CA3區，神經元固縮且深染，細胞周圍間隙增大呈空泡樣變。假手術組小鼠細胞排列層次分明，細胞結構完整，尼氏體呈深藍色。蝦青素3個劑量組小鼠海馬結構細胞排列整齊且層次分明，細胞結構完整，尼氏體呈深藍色，空泡樣變消失，尤其在CA1和CA3區神經元改善較為明顯。

2.5檢測海馬中SOD和MDA含量 模型對照組小鼠海馬組織中 SOD 活力值比假手術組顯著下降(P<0.05)，而MDA含量顯著升高(P<0.05)。相比于模型對照組，蝦青素3個劑量組均能提高SOD活力值，降低MDA含量，且呈劑量依賴性。蝦青素組200 mg·kg-1SOD活力值較模型對照組顯著升高(P<0.05)，而MDA值顯著降低(P<0.05)。蝦青素組100及50 mg·kg-1的SOD值及MDA值與模型對照組比較，差異無統計學意義(圖5)。

2.6檢測小鼠海馬三亞區ROS熒光 各組小鼠海馬結構CA1、CA3和DG區ROS熒光強度存在組間差異，假手術組3個亞區ROS熒光強度均低于模型對照組，且CA1區和CA3區的差異最明顯，差異有統計學意義(P<0.001)，說明單側頸總動脈結扎手術引起海馬3個亞區中ROS高；蝦青素3個劑量組灌胃后，蝦青素組200 mg·kg-1小鼠海馬結構CA1、CA3和DG區中ROS熒光強度均暗于其他兩個劑量組，與模型對照組比較，差異具有統計學意義(在CA1區P<0.01，在CA3和DG區均P<0.05)；而蝦青素組50 mg·kg-1和蝦青素組100 mg·kg-1海馬結構中3個亞區的ROS熒光強度較模型對照組均有所下降相似，但與模型對照組比較，差異無統計學意義(圖6)。

3 討論

參考國內外研究并無蝦青素給藥的劑量，大部分選擇25 mg·kg-1到100 mg·kg-1進行實驗[3]，因此本次實驗分別設置50，100，200 mg·kg-1(小、中、大)3個劑量組來探討蝦青素對VD小鼠的影響。

VD是指大腦中對記憶、認知和行為至關重要區域損傷引起的認知功能喪失，在一定程度上會影響日常生活[4]，目前并沒有有效的防治方法。已有研究報道蝦青素對缺血引起的神經損傷具有保護作用。同時蝦青素還能通過哺乳動物的血腦屏障[5]，作用于中樞神經系統，是一種潛在治療VD的藥物。本次實驗通過灌胃給予不同劑量蝦青素，考察藥物對于VD的防治作用。

圖4 5組小鼠海馬結構CA1、CA3和DG區尼氏染色(Bar：100 mm)

①與模型對照組比較，P<0.05。

本實驗采用永久性結扎單側頸總動脈建立VD模型，實驗中統一結扎右側頸總動脈(RUCCAO)，保留左側，小鼠的死亡率約為8%。術后Morris水迷宮實驗及強迫游泳實驗結果證實，模型對照組的平均逃避潛伏期時間及在水中的靜止時間均顯著高于假手術組(均P<0.05)，且平均逃避潛伏期時間在第3天后兩組時間差距變大，這表明兩組小鼠在學習記憶能力上具有顯著差異。Nissl染色結果表明模型對照組小鼠海馬神經元損傷嚴重，尤其在CA1和CA3區。上述行為學結果和形態學結果都證實采用永久性結扎單側頸總動脈能導致小鼠的學習記憶能力下降，并損害神經元，可用于的血管性癡呆小鼠模型建立。

藥物干預實驗結果證實，蝦青素3個劑量組平均逃避潛伏期時間及水中的靜止時間均低于模型對照組，其中蝦青素組200 mg·kg-1是3個劑量組中改善最明顯的與模型對照組相比差異有統計學意義，同時，Nissl染色結果表明，給予AST后VD小鼠海馬CA1區和CA3區神經元損傷較模型對照組明顯減輕，說明灌胃給藥蝦青素能夠減少VD小鼠海馬神經元損傷從而改善其學習記憶能力，且作用呈劑量依賴性。

①與模型對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05。

同時本次實驗還對蝦青素治療VD的機制進行了考察。蔣青等[6]認為氧化應激在血管性癡呆發生發展中扮演重要角色。正常情況下氧自由基會被機體自身的抗氧化物質如 SOD 清除，維持氧化系統和抗氧化系統動態平衡；而長期處于低氧低灌注的條件下，抗氧化物質的大量消耗導致羥自由基(·OH)等ROS積累，從而造成氧化應激損傷，是引起VD的重要機制。聚集在體內的ROS氧化生物膜誘發脂質過氧化反應，引起MDA和GSH含量以及SOD活性異常，最終損傷神經元[7]。因此體內ROS、SOD及 MDA含量能直接反映了氧化應激損傷的嚴重程度。本研究證實，血管性癡呆小鼠海馬結構中ROS含量和MDA含量較假手術組明顯升高，而SOD 活力值顯著下降，說明血管性癡呆小鼠腦內存在著明顯的氧化應激損傷。而蝦青素3個劑量組小鼠海馬結構中ROS熒光強度和MDA含量均低于模型對照組，SOD活力值高于模型對照組，且蝦青素組200 mg·kg-1效果最為明顯。說明蝦青素能夠通過抗氧化應激損傷機制對VD引起的認知功能障礙發揮神經保護作用。其原因可能是蝦青素具有較強的抗氧化性，能夠通過其抗氧化作用在多種疾病模型中發揮治療作用[8]。如蝦青素可以通過改變MDA、 GSH含量以及SOD活性來改善蛛網膜下腔出血，減輕早期腦損傷等[9]。

另外，本次實驗還發現Nissl染色中，模型對照組海馬三區神經元損傷以CA1區和CA3區最為嚴重，在DHE染色結果中，模型對照組海馬三區ROS水平以CA1和CA3區顯著高于假手術組。這一結果表明，在缺血狀態下海馬三區CA1和CA3區極容易受損。蝦青素干預后，海馬CA1區和CA3區神經元改善明顯，且兩亞區ROS水平降低異常顯著。盡管3個給藥組改善海馬神經元損傷效果相似，但分子生物學存在差異。這潛在的機制為后續研究提供了思路。

綜上所述，蝦青素能通過清除活性氧自由基、恢復抗氧化酶的活性等抗氧化作用來改善血管性癡呆小鼠模型認知功能，發揮神經元保護作用，且作用具有劑量依賴性，為蝦青素預防和治療血管性癡呆提供實驗依據。