姜黃素對鄰苯二甲酸二丁酯致昆明小鼠腎損傷的保護作用*

梁馮，晏彪

(1.湖北中醫藥大學檢驗學院，武漢 430065；2.湖北科技學院基礎醫學院，咸寧 437100)

姜黃素(curcumin，Cur)是一種具有抗氧化能力的自由基清除劑，可減輕腎臟肥大，減少系膜基質擴張；同時還對糖尿病腎病、腎缺血等急慢性腎臟疾病具有改善作用[1-2]。鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)作為主要塑化劑之一，能以不同的濃度浸入PVC醫療器械存儲的溶液中，臨床上某些人群包括透析患者和孕婦的血液或尿液，可能長期暴露于DBP[3]。流行病學研究顯示[4]，DBP及其代謝物與腎臟的一系列不良反應存在相關性，毒理學研究也證實DBP具有潛在的腎毒性[5]。本研究通過檢測Cur 對DBP暴露后KM小鼠腎組織氧化應激水平、細胞凋亡相關蛋白的表達以及血清中肌酐(creatinine，Crea)和尿素氮(urea-nitrogen，Urea)含量的影響，探究Cur的潛在作用及其機制。

1 材料與方法

1.1動物 3周齡SPF級雄性昆明(KM)小鼠28只，體質量(17±1) g，購自湖北省實驗動物研究中心[動物使用許可證號：SCXK(鄂)2015-0052]。小鼠飼養動物房溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%，晝夜交替12 h，自由攝食、飲水。

1.2藥品與試劑 Cur(Sigma公司，含量≥98.0%，批號：08511)，DBP(Sigma公司，含量≥99.6%，批號：84742)，小鼠血清Urea、Crea試劑盒(深圳市庫貝爾生物科技有限公司，批號：11.01.0105)，總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：A015-2)，半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3，Casp-3)試劑盒(BioVision公司，批號：K106-25)。Western blotting一抗：均為兔抗小鼠，β-actin(天德悅公司，批號TDY051，5%脫脂牛奶，1：10 000)，細胞外調節蛋白激酶(ERK)(CST公司，批號：4695，5%BSA，1：2000)，磷酸化ERK(p-ERK)(CST公司，批號4370，5%BSA，1：1000)；二抗：辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔抗體(ASPEN公司，批號：AS1107，5%脫脂牛奶，1：10 000)。免疫組化一抗：兔抗Bcl-2(武漢博士德生物工程有限公司，批號：ba0412)、Bax(武漢博士德生物工程有限公司，批號：ba0315)，二抗：羊抗兔IgG抗體、兔IgG過氧化物酶標記的生物素復合物(SABC-POD)及二氨基聯苯胺(DAB)。

1.3儀器與設備 iMagic-M7全自動生化分析儀(深圳市庫貝爾生物科技有限公司)，ELx800酶標儀(美國Bio-Tek)，蛋白電泳及轉膜系統(美國Bio-Rad)，凝膠成像及分析系統(英國Syngene)，RM2245切片機(德國Leica)，顯微鏡BX53 (日本Olympus)。

1.4動物分組及給藥 28只KM小鼠隨機分成4組：正常對照組、暴露組(50 mg·kg-1DBP，DBP組)、給藥組(2.5 mg·kg-1Cur)、暴露+給藥組(50 mg·kg-1DBP+2.5 mg·kg-1Cur，DBP+Cur)，每組7只。DBP 的暴露劑量參照YAN等[6]設置為50 mg·kg-1，暴露途徑為口腔灌胃；Cur的給藥劑量參考ALCANTARA 等[7]選擇為2.5 mg·kg-1，腹腔注射給藥；DBP+Cur組中Cur先腹腔注射給藥，2 h后再口腔灌胃DBP，實驗鼠給藥體積均為10 mL·kg-1，實驗周期28 d。

1.5測量指標及方法 實驗4周結束后，小鼠經心臟取血，采用小動物全自動生化分析儀測定各組小鼠的腎功能指標Urea、Crea。處死小鼠后，取約1.5 g的腎組織加預冷的PBS制成10%勻漿液，4 ℃，10 000×g離心10 min后取上清液，用于自由基(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及T-AOC水平的檢測。二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)熒光定量分析腎組織勻漿中ROS水平[8-9]；硫代巴比妥酸法(TBARS)測定腎組織勻漿中MDA含量，蛋白質含量用Folin酚法測定，MDA含量(μmol·mg-1)=[6.45(A532-A600)-0.56×A600](μmol·L-1)×樣本稀釋倍數/待測勻漿蛋白濃度(mg·mL-1)；用試劑盒測定腎組織勻漿中T-AOC水平，ELISA試劑盒測定Casp-3水平。Western blotting檢測各組小鼠腎組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達情況，采集β-actin、ERK1/2及p-ERK1/2條帶，以β-actin作內參，分別得到各樣品ERK1/2、p-ERK1/2與β-actin的灰度比值。對各組小鼠腎組織切片進行免疫組化染色，應用Image Pro Plus 6.0版軟件測定平均光密度值(以非染色區域為對照)，分析Bcl-2、Bax蛋白的表達。

2 結果

2.1各組小鼠腎功能指標的變化 各組小鼠血清Urea、Crea含量的變化，見圖1。DBP組Urea、Crea含量顯著高于對照組(t=3.99，4.98，P<0.01)；與DBP組相比，DBP+Cur組Urea含量顯著降低(t=-4.19，P<0.01)，Crea含量有一定程度地降低。

2.2各組小鼠腎組織氧化應激及Casp-3水平的變化 由圖2可見，與正常對照組比較，DBP組小鼠腎組織ROS、MDA、Casp-3水平顯著增加(t=12.60，P<0.01)(t=2.81，P<0.05)(t=8.84，P<0.01或P<0.05)，T-AOC水平顯著性降低(t=-2.66，P<0.05)；與DBP組比較，DBP+Cur組小鼠腎組織ROS、Casp-3水平均有顯著性降低(t=-5.08，-7.54，P<0.01)，T-AOC水平顯著上升(t= 2.75，P<0.05)。

2.3各組小鼠腎組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達 與正常對照組比較，DBP組小鼠腎組織p-ERK蛋白表達水平顯著上調(t=14.21，P<0.01)；與DBP組比較，DBP+Cur組p-ERK蛋白表達水平有一定程度下調；各組小鼠腎組織ERK表達未見明顯變化，見圖3。

1.正常對照組；2.DBP組；3.Cur給藥組；4.DBP+Cur組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與DBP組比較，P<0.01。

2.4各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax蛋白的表達 鏡下觀察，腎組織細胞核被染上了藍色，細胞質則顯示黃色(強陽性的地方呈現棕黃色)，Bcl-2、Bax均在細胞質中表達，見圖4A。DBP組小鼠腎組織中Bax的表達顯著高于正常對照組(t=11.33，P<0.01)；經Cur處理后，與DBP組比較，DBP+Cur組Bcl-2和Bax的比值顯著上升(t=4.43，P<0.05)，見圖4B。

3 討論

DBP是一種廣泛使用的增塑劑，可通過消化道、皮膚及醫療器械接觸等多種途徑進入人體，有數據顯示DBP及其代謝物在特殊人群尿液中的檢出率已超過90%[3]。輸血所用的PVC血袋釋放的DBP可以在人體的多個器官中積聚，DBP的殘留將可能嚴重影響輸血者的生殖、發育、免疫等系統[8]。以往的研究指出，DBP是一種過氧化物酶體增殖激活受體(PPARs)誘導劑，DBP介導的PPARs激活被認為是DBP引起肝腎毒性的主要機制之一[9]。事實上，DBP造成人類出現肝腎毒性的途徑可能不是由PPARs介導的；相反，PPARs的非依賴調節機制可能參與了這一過程[9]。本研究發現，DBP還可作為一種外源性氧化物，刺激機體產生氧化應激，活化ERK蛋白，甚至影響Bax、Bcl-2的比值以及Casp-3水平，從而導致腎功能出現障礙或異常。進一步發現，經Cur給藥處理后，DBP暴露組小鼠腎組織的氧化應激水平及促凋亡相關蛋白的表達下降，血清中Crea、Urea水平趨于正常，以上結果提示，Cur對DBP所致的腎損傷有一定的保護作用。

1.正常對照組；2.DBP組；3.Cur給藥組；4.DBP+Cur組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與正常對照組比較，P<0.05；③與DBP組比較，P<0.01，④與DBP組比較，P<0.05。

1.正常對照組；2.DBP組；3.Cur給藥組；4.DBP+Cur組；①與正常對照組比較，P<0.01。

1.正常對照組；2.DBP組；3.Cur給藥組；4.DBP+Cur組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與DBP組比較，P<0.05。

1.normal control group；2.DBP group；3.Cur group；4.DBP+Cur group；①compared with normal control group，P<0.01；②compared with DBP group，P<0.05.

Fig.4 Immunohistochemical staining (A) and mean optical density analysis (B) on renal tissue of four groups of mice(×200)

Crea、Urea是反映腎功能的兩個重要指標，血清Crea的顯著升高則提示腎小球濾過功能障礙，正常情況下，血清Crea水平能準確反映腎實質損害，血清Crea值偏高，大多意味著腎臟受損。腎實質損傷時腎小球重吸收減少，血清Urea水平也會相應升高[10]。尿素是哺乳動物蛋白質代謝的主要終產物，血清中尿素濃度主要受腎功能的影響。尿素排泄能力越強，腎功能狀態越好；反之，如果尿素排泄能力不足，這可能表明腎功能受損。結果表明，DBP組小鼠血清Crea和Urea水平明顯升高，提示DBP對小鼠腎細胞有嚴重的損傷作用，但給予Cur處理后，Crea和Urea水平明顯下降。

本研究進一步證實了DBP可以顯著提高腎組織ROS的水平，而ROS的積聚會改變細胞膜的穩態使MDA含量增加，同時降低抗氧化能力，最終導致更嚴重的組織損傷。此外，在氧化應激過程中產生的ROS作為上游信號分子參與了信號轉導途徑，并可誘導細胞凋亡或壞死，最終導致病理改變和器官功能障礙[11]。Cur具有抗氧化活性，經處理Cur后，DBP暴露后小鼠腎組織ROS、MDA水平下調，以及抗氧化能力得到提高。結果表明，氧化應激參與了DBP所致的腎功能障礙或異常，Cur可通過阻斷ROS的過量產生而發揮保護作用。

文獻[12]表明ERK及其磷酸化在腎相關疾病中可能發揮重要的作用。一些研究也指出，ERK的過度激活參與了糖尿病腎病的發生發展[13]。ERK是真核生物中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，ERK信號途徑也是細胞氧化應激反應中的關鍵通路。LEE等[14]發現氧化應激誘導的細胞凋亡可由ERK1/2磷酸化介導，ERK1/2通路被刺激信號激活，磷酸化激活的ERK1/2從細胞質轉移到細胞核，介導下游轉錄因子NF-κB和AP-1的激活，進而調節細胞增殖、分化、凋亡和其他生物學功能。已有研究表明[15]，DBP的同系物鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)作為細胞外信號可以激活p38MAPK引起相應的轉錄后生物學效應。因此，DBP引起的腎功能障礙可能與ERK通路的激活有關。結果表明，DBP組小鼠腎組織磷酸化ERK的總體水平高于對照組；相反，給予Cur處理后，DBP+Cur組ERK水平趨于降低，以保護腎組織的損傷。

目前Bcl-2是凋亡分子機制研究的主要靶分子，Caps-3是凋亡過程中的執行分子[16]。Bax、Bcl-2共屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2是細胞凋亡抑制基因，Bax不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且具有促進細胞凋亡的功能。Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，如果Bax相對量高于Bcl-2，則Bax同二聚體的數量增多，從而促進細胞死亡；而如果Bcl-2相對量高于Bax，則促進形成Bcl-2/Bax異二聚體，并使Bcl-2同二聚體的量增多，從而抑制細胞凋亡。本研究發現，DBP組小鼠腎組織中Bax、Bcl-2水平均有升高，但Bax相對量更高，提示有促凋亡的趨勢，這與沈華等[17]報道DBP孕期暴露導致子代大鼠睪丸細胞凋亡的觀察結果一致。給予Cur處理后，DBP+Cur組Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明細胞對凋亡的抵抗性增強，提示Cur具有抑制凋亡的作用。

綜上所述，姜黃素對DBP所致小鼠腎損傷的保護作用，或與其可阻斷DBP誘導的自由基形成有關，另一方面，Cur的保護作用還可能與抑制細胞凋亡途徑的p-ERK、Bax以及Casp-3高表達相關。鑒于Cur藥理作用的復雜性，對DBP引起的腎損傷的保護機制尚待進一步研究。