多穗柯總黃酮對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用*

劉曉東，溫雯靜，趙志軍

(漯河醫學高等專科學校，河南漯河 462002)

肝臟是人體重要的代謝器官，肝損傷會對人的生活質量產生較大的影響。目前，伴隨人們生活方式的改變以及環境的變化，肝病呈現明顯的上升趨勢。其中化學性肝損傷是比較常見的發病原因，嚴重時易導致肝硬化和肝癌的發生[1]。四氯化碳(CCl4)是常用的誘導肝損傷的化學溶劑，容易導致肝細胞分泌大量的炎癥因子，加大炎癥反應，同時還可通過促進細胞膜脂質過氧化，誘發肝損傷的發生[2]。

多穗柯(lithocarpus polystachyus Rehd.) 為常見的民間草藥，具有清熱利尿、滋潤肝腎等功效。研究顯示，多穗柯含有豐富的黃酮類化合物，含量達到10%，具有抗炎、抗氧化、降血脂等功能，但對于肝損傷的影響鮮有報道[3]。本研究采用CCl4誘導小鼠肝損傷建立動物模型，觀察多穗柯總黃酮(total flavonoids extracts ofLithocarpuspolystachyusRehd，TFL)對其保護作用，并分析其保肝作用的機制。

1 材料與方法

1.1動物 健康清潔級昆明小鼠60只，雄性，體質量(22±2) g，購自河南省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(豫)2015-0005，使用許可證號：SYXK(豫)2016-0002。飼養溫度為(24±2) ℃，12 h光照/12 h黑暗的室內，常規飼料，自由飲水進食，適應1 周后進行實驗。

1.2實驗藥物 多穗柯采集于貴州省貴陽市花溪區，經漯河醫學高等專科學校趙喜蘭副教授鑒定為殼斗科櫟屬常綠植物。按照預實驗，準確秤取干燥的多穗柯葉5 kg，選擇70%乙醇按照1：20 的料液浸泡12 h，70 ℃、540 W 條件下，采用超聲波提取儀提取 3 次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得濃縮液。濃縮液上AB-8大孔樹脂，選擇75%乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空冷凍干燥得 TFL粉末。亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測得總黃酮質量分數為87.2%。

1.3試劑 水飛薊素，純度≥98%(大連美侖生物技術有限公司，批號：M1120A)；CCl4(廣州市金華大化學試劑有限公司，批號：171103)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20170812，20170927，20170823，20170818，20170924，20170815，20170813，20171108)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：P0012S)；一抗含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)(批號：ab232401)、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)(批號：ab47092)、caspase-1(批號：ab179515)、GAPDH(批號：ab181602)及二抗IgG(羊抗兔，批號：ab150077)，均為美國Abcam公司。

1.4儀器 AL104 型電子天平(瑞士梅特勒托利多儀器公司，感量：0.1 mg)；RE-52AA 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV-2501PC 型紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.5方法

1.5.1分組及造模 60只昆明小鼠按隨機數字表分成6組，正常對照組、模型對照組、水飛薊素組(水飛薊素120 mg·kg-1)、TFL小、中、大劑量組(50，100，150 mg·kg-1)。小鼠飼養一周后開始試驗，灌胃體積為15 mL·kg-1，正常對照組、模型對照組灌胃等劑量的0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續給藥7 d。末次給藥2 h后，模型對照組及各給藥組小鼠按劑量5 mL·kg-1腹腔注射6% CCl4橄欖油溶液，正常對照組小鼠腹腔注射同體積橄欖油，禁食不禁水。

1.5.2相關指標測定 造模6 h，摘眼球取血，半徑為13.5 cm，3000 r·min-1離心 10 min，分離血清，測定血清ALT、AST水平。小鼠處死，取肝臟，4 ℃0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干稱重，并計算肝指數(肝指數/%=肝質量×100/體質量)。秤取肝左葉100 mg，加入0.9%氯化鈉溶液冰浴勻漿，半徑為13.5 cm，4 ℃，3500 r·min-1離心10 min，取上清液，測定IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、GSH-Px、MDA水平。

1.5.3肝組織學觀察 取肝右葉用10%甲醛固定，石蠟包埋，常規切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，并進行常規組織學觀察。

1.5.4蛋白水平的測定 采用Western blotting法，常規方法提蛋白質，調整各樣本蛋白總量，參照說明書行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，孵育二抗，Bio-Rad凝膠成像系統成像拍照，以GAPDH為內參分析待測蛋白相對表達值。

2 結果

2.1多穗柯總黃酮對體質量和肝指數的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠的肝質量、肝指數均明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，水飛薊素組、TFL中、大劑量組肝質量、肝指數均明顯降低(P<0.01)，而對小鼠體質量無明顯影響。見表1。

2.2多穗柯總黃酮對ALT、AST的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠ALT、AST活力均明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，水飛薊素組、TFL中、大劑量組ALT、AST活力均明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.3多穗柯總黃酮對肝組織 IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠的肝組織 IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，水飛薊素組、TFL中、高劑量組肝組織 IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P<0.01)。見表3。

表1 多穗柯總黃酮對體質量和肝指數的影響

表2 多穗柯總黃酮對ALT、AST的影響

Tab.2 Effect of TFL on ALT and AST

表2 多穗柯總黃酮對ALT、AST的影響

組別ALTAST正常對照組67.13±11.3884.32±10.29模型對照組203.48±21.28①170.12±15.48①水飛薊素組149.25±16.03②98.26±13.46②TFL 小劑量組196.37±20.27160.26±14.27 中劑量組151.27±17.16②119.42±12.47② 大劑量組141.46±15.72②101.27±10.36②

①與正常對照組比較，t=14.616～17.868，P<0.01；②與模型對照組比較，t=6.46～11.689，P<0.01。

①compared with normal control group，t=14.616-17.868，P<0.01；②compared with model control group，t=6.46-11.689，P<0.01.

2.4多穗柯總黃酮對肝組織SOD、GSH、MDA水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠的肝組織SOD、GSH水平均明顯降低，MDA明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，水飛薊素組、TFL中、大劑量組肝組織SOD、GSH水平均明顯升高，MDA明顯降低(P<0.05)。見表4。

2.5肝組織學觀察 模型對照組小鼠肝細胞出現空泡樣變，部分肝細胞壞死。水飛薊素組小鼠肝小葉結構基本正常，空泡樣變和肝細胞壞死明顯減少；與模型對照組比較，不同劑量多穗柯總黃酮均能有效改善肝組織損傷，空泡樣變和肝細胞壞死明顯減少。見圖1。

表3 多穗柯總黃酮對肝組織 IL-1β以及血清IL-6、TNF-α水平的影響

Tab.3 Effect of TFL on the IL-1β level in liver tissue and the serum levels of IL-6 and TNF-α

表3 多穗柯總黃酮對肝組織 IL-1β以及血清IL-6、TNF-α水平的影響

組別IL-1βIL-6TNF-α正常對照組8.82±0.588.24±0.380.66±0.13模型對照組19.28±1.26①17.01±1.67①1.48±0.58①水飛薊素組11.12±0.26②10.02±0.42②0.79±0.12②TFL 小劑量組17.38±1.3613.28±1.581.27±0.46 中劑量組14.18±0.98②10.48±1.36②0.81±0.19② 大劑量組11.26±0.86②9.06±1.21②0.69±0.37②

①與正常對照組比較，t=4.362～16.192，P<0.01；②與模型對照組比較，t=3.471～20.057，P<0.01。

①compared with normal control group，t=4.362-16.192，P<0.01；②compared with model control group，t=3.471-20.057，P<0.01.

表4 多穗柯總黃酮對肝組織SOD、GSH、MDA水平的影響

組別SOD/(U·mg-1)GSH/(mg·g-1)MDA/(nmoL·mg-1)正常對照組104.27±4.787.26±1.591.55±0.45模型對照組38.57±2.48①3.05±0.78①4.35±0.53①水飛薊素組88.39±4.15②5.59±0.66②2.38±0.48②TFL 小劑量組53.46±3.58②3.75±0.72②3.68±0.49② 中劑量組75.28±2.47②5.08±0.76②3.12±0.53② 大劑量組82.47±2.67②5.72±0.42②2.42±0.47②

2.6蛋白水平的測定 與正常對照組比較，模型對照組小鼠的肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1水平均明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，水飛薊素組、TFL小、中、大劑量組的肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1明顯降低(P<0.01)。見圖2，表5。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.水飛薊素組；D.TFL小劑量組；E.TFL中劑量組；F.TFL大劑量組。

1.正常對照組；2.模型對照組；3.水飛薊素組；4.TFL小劑量組；5.TFL中劑量組；6.TFL大劑量組。

3 討論

肝損傷主要涉及肝病進展，包括炎癥、纖維化、肝硬化和肝細胞癌。正常的肝細胞是容易受到食源性毒素、嗜肝病毒的感染和細菌感染。研究顯示，CCl4可通過氧化脅迫和脂質過氧化誘導的急性肝損傷[4]。CCl4

表5 多穗柯總黃酮對肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1水平的影響

代謝時，可生成大量自由基，誘發脂質過氧化以及級聯反應，嚴重時改變細胞膜的通透性，從而觸發肝毒性，并出現肝組織損傷，釋放部分活性物質進入血液中[5]。本研究中，模型對照組小鼠血清中AST、ALT水平明顯高于對照組，結合病理切片觀察，顯示模型對照組小鼠肝細胞出現空泡樣變，部分肝細胞壞死，說明急性肝損傷的動物模型建立成功。本研究中，TFL給藥組ALT，AST水平較模型對照組明顯降低，結合病理切片觀察，顯示不同劑量的TFL均能有效改善肝組織損傷，并具有一定的劑量效應，說明TFL對急性肝損傷大鼠具有一定程度的保護作用。

GSH是一種重要的抗氧化劑，可以清除ROS所致肝毒性。SOD負責將超氧陰離子轉化為過氧化氫。 MDA是脂質過氧化標記物。當CCl4誘發較高水平自由基時，GSH、SOD將被大量消耗，此時膜結構損傷明顯加重，脂質過氧化產物MDA水平顯著增加[6]。因此SOD、GSH和MDA水平能反映CCl4誘發的氧化應激所致肝損傷的程度。在這項研究中，TFL給藥可顯著增加肝臟抗氧化能力，如其特征在于TFL可以減少CCl4所致氧化應激中MDA水平，升高抗氧化劑SOD、GSH水平，抑制肝細胞脂質過氧化，維持膜的正常結構，從而避免肝細胞的損傷，同時也提示TFL可通過抗氧化應激發揮對肝損傷的保護作用。

越來越多的證據表明，壞死、炎癥反應在CCl4誘導的肝細胞毒性中起重要作用[7]。其中TNF-α在肝損傷發生過程中扮演著重要的角色，可誘發肝星形細胞分泌、釋放多種炎性遞質。同時還會活化中性粒細胞，導致超氧陰離子和蛋白酶水平明顯增加，從而產生級聯反應，并導致肝損傷的發生。而IL-1β主要可以導致組織局部炎癥反應，并作用于單核巨噬細胞，誘發IL-6 的合成和分泌，而IL-6的異常升高會進一步導致肝細胞發生免疫病理反應[8]。因此，TNF-α、IL-1β和IL-6能反映肝損傷的程度[8]。本研究中，TFL對CCl4所致急性肝損傷通過下調炎癥誘導肝臟炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6發揮保護作用。

NLRP3 炎性復合體屬于NLR家族成員，主要表達于單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞，易被活性氧(ROS)等因素活化。而CCl4誘發的氧化應激所致的膜脂過氧化損傷常導致較高水平的ROS的發生[9]。因此。肝損傷發生時，高水平的ROS的釋放是激活 NLRP3 的重要途徑，是NLRP3激活的近端信號。當NLRP3 受到內外源性因素影響時，其將發生低聚化，并募集 pro-caspase-1 和ASC 共同組建形成 NLRP3 炎性小體，并調節、活化pro-caspase-1 轉變成有活性的Caspase-1，在此基礎上，通過剪切IL-1β前體，激活其成熟和分泌，從而發揮生物學作用[10]。因此，調控NLRP3 炎性小體也是對肝損傷發揮保護作用的重要機制。本研究中，TFL能顯著降低NLRP3、ASC、Caspase-1水平，表明TFL抑制 NLRP3 炎癥小體介導的炎癥反應是其發揮對急性肝損傷保護作用的重要機制。

總之，TFL對CCl4誘導的肝細胞損傷的保護作用，與減輕氧化應激水平，改善炎癥因子的產生，調控ROS/NLRP3/IL-1β信號通路有關。通過闡明TFL保護CCl4誘導的肝細胞損傷機制，可以為臨床急性肝損傷的治療提供參考，同時也為多穗柯的開發提供依據。