長春西汀在大鼠尿液中的代謝物研究

唐蕾，艾超

(清華大學附屬北京清華長庚醫院藥學部，清華大學臨床醫學院，北京 102218)

長春西汀(vinpocetine)是從夾竹桃科小蔓長春花中提取出的一種吲哚類生物堿，化學名為乙基阿樸長春胺-22-乙酸乙酯，系腦血管擴張劑，能維持或恢復腦血管的生理性擴張，增加缺血區的正常腦血流量，改善缺氧腦組織的代謝[1-2]。長春西汀脂溶性較強，進入體內之后可以迅速轉化成其活性代謝物阿樸長春胺酸[3-4]而發揮藥效，臨床應用廣泛而重要。

目前有薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)、質譜法(mass spectrum,MS)、放射色譜法、紅外光譜法(infrared absorption spectrum,IR)測定生物樣品中長春西汀或阿撲長春胺酸單一成分。但所采用的放射色譜法、紅外光譜法等分析方法靈敏度低、樣品制備繁瑣并且對人體輻射危害較大。因此筆者在本實驗擬采用快速、靈敏、專屬的液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)技術對長春西汀在大鼠體內的代謝進行研究，推測其在體內可能的代謝途徑，為長春西汀的體內代謝研究提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1儀器 Waters Quattro Micro API型三重四極桿串聯質譜儀，配備電噴霧離子化源(ESI源)及Masslynx 4.1 系統軟件，美國Waters公司；ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；L-128B型試管氮吹濃縮儀(北京來亨科貿有限公司)；L-119 型試管恒溫加熱儀(上海來亨科貿有限公司)；TGL-16G臺式離心機(上海安亭儀器廠)；AL-104型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.1 mg]。

1.2試藥 長春西汀對照品(含量：99.4%，批號：100947-201203，中國食品藥品檢定研究院)；阿樸長春胺酸對照品(含量：99.8%，批號：1166-002A3，加拿大TLCPharmaChem Inc公司)；長春西汀片劑(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，規格：每片5 mg)；甲醇為色譜純，購自TEDIA，純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

1.3動物 健康雄性SD大鼠6只，體質量230～240 g，沈陽藥科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2010-0001號。飼養條件：溫度(22±2) ℃，相對濕度(50±10)%，12 h交替照明，自由進食進水。

1.4樣品的收集與處理

1.4.1給藥方案與樣品的收集 給藥方案：健康SD大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水。以相當于長春西汀4 mg·kg-1的劑量灌胃給藥，給藥后繼續禁食4 h(長春西汀成人用法用量，30 mg·d-1。換算SD大鼠計量4 mg·kg-1)，大鼠尿液樣品的收集：每只大鼠單獨置于代謝籠內飼養，12 h 晝夜更替。實驗前收集空白尿液，灌胃給藥后，于冰浴條件下收集0～24 h尿液樣品，置-80 ℃冷凍保存，待測。

1.4.2樣品預處理 采用固相萃取的方法進行預處理，用甲醇、水各3.0 mL 交替活化固相萃取小柱各兩次。取3500 r·min-1，離心半徑r=6.5 cm，離心10 min后的尿液樣品1 mL，微孔濾膜過濾，以1.5 mL·min-1速度通過上述已經活化好的固相萃取柱，依次用水1 mL，甲醇(1 mL×2)洗脫，收集甲醇部分的洗脫液，于40 ℃氮氣下吹干，殘渣用甲醇-水(10：90，V/V)混合溶液100 μL 溶解，20 μL進樣分析。

1.5LC-MS/MS分析條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；流動相為甲醇-水梯度洗脫：甲醇在15 min內從10%線性變化至95%，維持3 min，之后恢復到初始條件，平衡3 min；流速：0.2 mL·min-1；進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃。

1.5.2質譜條件 離子源為電噴霧離子化源(ESI源)；毛細管電壓為2.0 kV；錐孔電壓為40 V(長春西汀、阿樸長春胺酸)和20 V(內標非那西汀)；去溶劑氣為氮氣(N2)；去溶劑氣溫度為400 ℃；源溫度為110 ℃；去溶劑氣流速為450 L·h-1，采用正離子方式檢測；采用一級全掃描、選擇離子監測和產物離子掃描方式同時進行測定。

2 結果

2.1長春西汀的質譜裂解規律 見圖1，2。由圖1可知，長春西汀原型M0(m/z351)含有酯鍵不穩定，容易斷裂生成阿樸長春胺酸(M1m/z323)；M0和M1易脫掉含氮的三元環、四元環和五元環生成m/z308、m/z280、m/z266的碎片離子。

圖1 M0的二級質譜圖及其化學結構式

2.2大鼠尿液中的代謝研究 大鼠空白尿液樣品和灌胃給予長春西汀后尿液樣品的SIR色譜圖見圖3所示。同空白尿樣相比，給藥后的大鼠尿樣中共檢測到4種代謝物。通過與對照品的色譜、質譜行為比較，鑒定了1個代謝物的結構，為阿樸長春胺酸(M1)。通過綜合分析色譜保留行為、準分子離子和二級碎片離子，并根據藥物代謝規律，推斷了3個代謝物的結構 (M2a/M2b、M3、M4)。

代謝物M1。色譜保留時間為5.6 min。準分子離子峰[M+H]+為m/z323，通過與阿樸長春胺酸的對照品比對，鑒定出M1為阿樸長春胺酸，M1的質譜圖和裂解規律見圖4，5。

圖2 推測的M0質譜裂解規律

圖3 大鼠尿液中長春西汀代謝物的典型SIR色譜圖A.空白尿液；B.含藥尿液

圖4 M1的色譜圖及其準分子離子峰的二級質譜圖A.對照品；B.含藥尿液樣品；C.二級質譜圖

圖5 推測的M1質譜裂解規律

代謝物M2。色譜保留時間為12.4和13.3 min，準分子離子峰[M+H]+為m/z367，比原型藥物多16 Da，提示可能為長春西汀的一羥基化代謝物。在LC-MS/MS分析中，產生碎片離子m/z323、m/z294和m/z280。其中，m/z323為與原型一致的酯鍵水解生成的碎片離子，m/z294和m/z280推測為分別脫掉含氮的四元環和含氮的五元環生成的碎片離子(圖6)。由文獻[5]可知羥化位點存在于苯環上，但具體的羥化位點不確定，推測M2a和M2b為苯環上羥化部位不同的兩個同分異構體。M2的質譜裂解規律見圖7。

圖6 M2的二級質譜圖及其化學結構式

圖7 推測的M2質譜裂解規律

代謝物M3。色譜保留時間為10.6 min，準分子離子峰[M+H]+為m/z369，比原型藥物的準分子離子多18 Da，提示其可能為長春西汀一水加成物。在LC-MS/MS分析中，產生的碎片離子m/z351推測為脫掉水生成的碎片，并且m/z351進一步生成的碎片離子m/z323、m/z294、m/z280和m/z308與M0的碎片一致，根據文獻[5]推測M3為M0的一水加成物。見圖8。

代謝物M4。色譜保留時間為11.5 min，準分子離子峰[M+H]+為m/z383，與原型藥相比多32 Da，提示其可能為長春西汀二羥基化代謝物。在LC-MS/MS分析中，產生碎片離子m/z367、m/z337和m/z305，其中m/z367的碎片離子比m/z383的碎片離子少16 Da，提示為后者脫掉一個羥基上的氧生成的碎片離子，m/z337的碎片離子推測為在m/z367的基礎上脫掉側鏈上的乙基再生成雙鍵產生的碎片離子，m/z305的碎片離子比m/z337的碎片離子少32 Da，提示由后者進一步脫掉2個氧生成的碎片離子。見圖9。因此，推測代謝物M4為長春西汀的二羥基化代謝物，但是具體的羥化位點不確定。M4的質譜裂解規律見圖10。

圖8 M3的二級質譜圖及其化學結構式

圖9 M4的二級質譜圖及其化學結構式

圖10 推測的M4質譜裂解規律

2.3長春西汀在大鼠尿液中代謝的總結 根據檢測到的上述代謝物，可以推斷長春西汀在大鼠尿液中有4種代謝途徑，分別為酯鍵水解，一水加成，一羥基化和二羥基化，均屬于Ⅰ相代謝。

3 討論

關于長春西汀的體內代謝研究，VERECZKEY[5]采用薄層色譜法(TLC)和質譜法(MS)結合的方法研究了長春西汀在比格犬體內的代謝，共檢測出3種代謝物：阿樸長春胺酸、一羥基化長春西汀和二羥基化阿樸長春胺酸甘氨酸結合物；VERECZKEY等[6]采用放射色譜法、MS和紅外光譜法(IR)結合的方法研究了長春西汀在大鼠體內的代謝，檢測到的代謝物與文獻[5]一致。YANG等[7]總結了長春西汀及其結構類似物在大鼠、兔、犬及人體內的代謝物，除了以上3種外，還有一羥基化阿樸長春胺酸、長春西汀一水合物、二羥基化阿樸長春胺酸甘氨酸結合物及與葡萄糖醛酸或硫酸的結合物。本實驗對長春西汀在大鼠體內的代謝情況進行了初步研究，對大鼠尿液中長春西汀代謝物的結果分析，通過與代謝物對照品的色譜、質譜行為比較，鑒定了1個代謝物的結構(M1)，通過綜合分析色譜保留行為、準分子離子和二級碎片離子，推斷了3個代謝物的結構 (M2、M3、M4)，分別是M1-阿樸長春胺酸、M2-長春西汀一羥基化合物、M3-長春西汀一水加成物和M4-長春西汀二羥基化合物，M4筆者目前尚未見文獻報道，為長春西汀的體內代謝研究提供借鑒和參考。