基于網絡藥理學的“黃連-三七”藥對抗2型糖尿病作用機制*

田會東，王靜，郭麗娜，賈明璐，陳雪平，王瑞

(1.河南省漯河市中心醫院藥學部，漯河 462000；2.漯河醫學高等專科學校，漯河 462000)

近年來，隨著我國人口老齡化與生活方式及飲食結構的改變，糖尿病已經從少見病變成一個流行病，2型糖尿病患病率持續攀升[1]。據最新數據顯示，我國成人糖尿病的患病率達10.9%，患病人數居世界之首[2]。2型糖尿病及其并發癥嚴重危害人類健康，并給社會帶來巨大的經濟負擔。因此，抗2型糖尿病藥物的研究，已經成為當今醫藥研究領域的熱點和難點。中藥因具有“多成分-多靶點-多通路”發揮整體協同作用的特點，在治療糖尿病及其并發癥等疾病方面具有得天獨厚的優勢。中醫認為，2型糖尿病及其并發癥是由于機體燥熱內盛、煉液為痰、血流滯澀所致，治療應以清熱燥濕、化痰通絡為主[3]。黃連是毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖，性寒、味苦，具有清熱潤燥的療效[4]；三七為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根莖，性溫、味甘，具有活血通絡之效[5]；二者配伍正體現清熱潤燥、益氣活血法治療“消渴癥”的基本方法。現代中醫臨床發現，黃連-三七在很多中藥處方中都有體現，是中醫治療糖尿病的常用藥對[6- 7]。然而，由于中藥多成分多靶點等特點，黃連-三七藥對抗2型糖尿病的作用機制尚未完全闡明。網絡藥理學是一種新的研究藥物作用機制的方法，廣泛應用于中藥復方的研究，為中藥作用機制的研究開辟了新的思路[8]。因此，本研究采用網絡藥理學方法，對“黃連-三七”藥對主要活性物質、作用靶點及信號通路對其抗2型糖尿病的作用機制進行探索，旨在為黃連-三七抗2型糖尿病的進一步探索提供科學依據。

1 材料與方法

1.1篩選活性成分及相應靶點 分別以黃連、三七為關鍵詞，從中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)(http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php) 中獲取所有化學成分。把口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為篩選條件[9]，從而得到活性成分。其中OB和DL是篩選活性成分的重要指標，OB、DL值越高，表明其越有可能被開發成為藥物[10-11]。活性成分的作用靶點從TCMSP數據庫中獲得，把靶點名稱輸入UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)，獲得其相應靶點的人源的靶點基因名稱。

1.2構建“活性成分-靶點蛋白”網絡 將黃連-三七藥對篩選出的活性成分和UniProt數據庫獲得的人源靶點導入Cytoscape 3.6.1版軟件，運用Network Analyzer插件分析構建“活性成分-靶點蛋白”的網絡圖。

1.3構建抗2型糖尿病靶點蛋白互作(protein protein interaction,PPI)網絡 運用比較毒物基因組學數據庫(comparative toxicogenomics database,CTD)(http：//ctdbase.org/)和治療靶點數據庫(therapeutic target database,TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)，以“Type 2 Diabetes”為關鍵詞，檢索與2型糖尿病相關的靶點，將得到的靶點基因輸入STRING在線分析平臺(https：//string-db.org/)，選擇分值大于0.7(高置信度評分)[12]，預測靶點與靶點之間的相互作用關系，構建抗2型糖尿病靶點PPI網絡圖。

1.4網絡合并 運用Cytoscape 3.6.1版軟件中的Merge功能將活性成分-靶點網絡和抗2型糖尿病PPI網絡合并，觀察是否有交集網絡。有交集的蛋白靶點可能是抗2型糖尿病的關鍵靶點。

1.5通路富集分析 運用DAVID6.8數據庫對黃連-三七抗2型糖尿病靶點蛋白，進行基因的本體(gene ontology，GO)生物學過程富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并以P<0.05作為篩選條件，結果用在線制圖平臺Omishare Tools可視化處理，進一步闡明靶點蛋白在信號通路中的作用。

2 結果

2.1主要活性成分 文獻[13]，皂苷類化合物口服，會被代謝生成次生皂苷或苷元，而真正在體內發揮療效的多為次生苷或苷元。TCMSP 數據庫對此以“皂苷-qt”表示，為準確模擬化合物在體內的真實情況，本研究對皂苷類化合物也以后綴qt 的形式進行描述。通過TCMSP數據庫共獲得167個黃連-三七對藥的已知成分，黃連成分有48個，三七成分有119個；以OB≥30%和DL≥0.18作為篩選條件獲得20個成分，其中黃連14個，三七7個，共有相同化合物1個。20個化合物中有3個化合物在TCMSP數據庫沒有篩選到相關作用靶點。因此，本研究共納入黃連-三七對藥的17個成分作為候選化合物，如表1所示。

2.2“活性成分-靶點”網絡圖構建 從UniProt數據庫得到人源靶點基因共116個，將活性成分與作用靶點通過Cytoscape 3.6.1構建成網絡圖，如圖1所示。圖1包含133個節點(17個活性成分和116個相關靶點)和261條線，其正八邊形代表活性成分，三角形代表相關靶點，線代表活性成分與相關靶點的關系。據報道，度值(degree)和介數值的節點(betweenness)與活性成分的重要性呈正相關，即其值越大，相應的節點在此網絡圖中越重要[14]。結果顯示，槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、氫化小檗堿[(R)-canadine]等化合物和前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、前列腺素G/H合成酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、5α鈉通道蛋白、核受體激活劑2等靶點蛋白在網絡圖中具有樞紐作用，可能是關鍵的活性成分和靶點蛋白。這也充分說明了黃連-三七藥對是以多成分、多靶點協同作用的特點。

表1 黃連-三七藥對篩選后得到的17個活性成分

圖1 活性成分-靶點網絡圖

2.3抗2型糖尿病靶點PPI網絡構建 在TTD數據庫檢索到抗2型糖尿病靶點75個，其中具有人源基因的靶點53個，在CTD數據庫中檢索到有直接證據來源的靶點211個，將這些靶點輸入STRING在線分析平臺，從而構建抗2型糖尿病靶點PPI網絡，如圖2所示。

2.4合并網絡 運用Cytoscape 3.6.1版軟件中的Merge功能將活性成分-靶點網絡和抗2型糖尿病靶點PPI網絡合并，獲得交集網絡圖，見圖3。從而得到黃連-三七藥對發揮抗2型糖尿病作用的化合物15個，包括槲皮素、β-谷甾醇、黃連堿、巴馬汀、小檗浸堿等；關鍵靶點19個，包括胰島素受體、前列腺素G/H合成酶2、二肽基肽酶IV、腸道麥芽糖酶-葡糖淀粉酶、凋亡調節因子Bcl-2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ等，見表2。

圖2 抗2型糖尿病靶點PPI網絡

2.5通路富集分析 運用DAVID平臺進行GO功能富集分析得到111個GO條目(P<0.05)，其中生物過程(biological process,BP)條目92個，細胞組成(cellular component,CC)條目12個，分子功能(molecular function,MF)相關的條目7個，見圖 4。KEGG通路富集，篩選出21條信號通路(P<0.05)，涉及HIF-1信號通路、胰島素抵抗通路、脂肪細胞脂解調控通路、PI3K-Akt信號通路等，見圖5。

圖3 抗2型糖尿病作用活性成分-靶點網絡

其中準確度最高(P最小)的通路為HIF-1信號通路。缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是由α和β亞單位組成一種異源二聚體，屬于轉錄因子堿性螺旋-環-螺旋家族蛋白。HIF與細胞和組織內的能量代謝有關，在缺氧條件下，可上調糖酵解途徑，降低線粒體功能來維持細胞代謝平衡，并且HIF還參與肝內糖類和脂質代謝[15]。由DAVID6.8平臺富集的HIF-1信號通路圖可知(圖6)，黃連-三七通過作用于EGFR、IL-6、HMOX1、bcl-2、NOS3、NOS2、INSR等7個靶蛋白調控HIF-1信號通路，起到抗2型糖尿病及其并發癥的作用。

表2 核心靶點信息

圖4 核心靶點GO富集分析

圖5 核心靶點GO富集分析

3 討論

中醫藥學有相對完備的理論基礎，在防治糖尿病方面具有優勢，中藥能有效降低糖尿病的發病率已逐漸得到驗證[16]。本研究采用網絡藥理學方法預測了黃連-三七對藥抗2型糖尿病的主要活性成分及潛在分子作用機制。由抗2型糖尿病作用活性成分-靶點網絡可知，15種成分能對2型糖尿病的相關靶點產生作用，其中6種來自三七，10種來自黃連，槲皮素是黃連和三七的共有成分。據報道槲皮素具有顯著的降糖功效，可通過降低大鼠血清抵抗素從而改善胰島素抵抗，并對空腹血糖、空腹胰島素水平有直接降低作用[17]。這也為兩藥聯合抗2型糖尿病的合理性提供理論依據。

從交集網絡靶點可知，黃連-三七抗2型糖尿病是多靶點協同作用的結果。研究證實，IL-6可促進肝臟合成超敏C反應蛋白(hs-CRP)等急性時相蛋白，促進炎癥發生，是2型糖尿病的獨立影響因素之一[18]；抑制二肽基肽酶4(dipeptidyl-peptidase 4,DPP4)，可以阻斷對GLP-1的降解，因此增加了體內內源性GLP-1水平和活性，從而促進胰島素分泌[19]；過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)基因定位予3p25，屬于轉錄因子的核激素受體超家族，在調節胰島素敏感性方面具有重要作用[20]。這些研究報道部分預示著通過網絡藥理學預測黃連-三七藥對作用靶點和通路的可行性，可以把IL6、PTGS2、DPP4、SCD、PPARG等19個關鍵靶點作為黃連-三七抗2糖尿病的潛在作用靶點深入研究其分子作用機制。

圖6 HIF-1信號通路

從GO富集分析可知，靶點主要富集在BP(生物過程)環節，如氧化應激，炎癥應答，細胞對鎘離子反應等；KEGG通路富集分析發現HIF-1信號通路、胰島素抵抗通路、脂肪細胞脂解調控通路、PI3K-Akt信號通路等與2型糖尿病密切相關，其中胰島素抵抗通路直接與糖尿病相關，表明黃連-三七具有良好的抗2型糖尿病效果。HIF-1信號通路準確度最高(P=1.0×10-7)，是黃連-三七主要抗2型糖尿病途徑。研究表明，缺氧貫穿于糖尿病并發癥發病機制的始終[21]。HIF-1α作為調節細胞內氧代謝的關鍵因子之一，是目前發現的唯一能在特異性缺氧狀態下發揮活性的轉錄因子，對糖尿病及其并發癥的發生、發展起促進作用[22-23]。本研究發現黃連-三七能作用于HIF-1信號通路上EGFR、IL-6、HMOX1、bcl-2、NOS3、NOS2和INSR 7個靶點，證明黃連-三七的抗2型糖尿病作用可通過調控HIF-1信號通路實現。Akt是PI3K通路末端重要的靶蛋白，PI3K-Akt通路在胰島素調節血糖穩定方面發揮作用，孟昭杰[24]發現黃連素能上調糖尿病患者受損的Akt活性，促進GLUT4轉位，從而改善胰島素抵抗，這與本研究富集在PI3K-Akt通路的結論是吻合的。叉頭轉錄因子(FoxO)是體內一重要的轉錄因子，已證實與糖代謝密切相關[25]；據王水秀等[26]報道，NF-κB信號通路的活化與炎癥反應及胰島素抵抗的發生密切相關；這些通路也可能是黃連-三七抗2型糖尿病的主要途徑之一。

本研究首次采用網絡藥理學的方法對“黃連-三七”藥對抗2型糖尿病的復雜機制進行了探究，成功預測了黃連-三七藥對抗2型糖尿病的主要活性成分、作用靶點和相關信號通路，體現了中藥復方多成分、多靶點、多通路的特點，為進一步深入探討作用機制奠定基礎，同時也為中藥復方治療2型糖尿病的物質基礎和作用機制提供了借鑒。誠然，網絡藥理是一種新興的研究方法，本研究的結論仍存在局限性，尚需要基礎和臨床藥理試驗的進一步驗證。