解毒抗癌巴布劑中主要成分體外釋放度及離體小鼠經皮滲透行為研究*

黃文濤，張耕，胡松，楊全偉

(武漢市第一醫院藥學部，武漢 430022)

解毒抗癌巴布劑為武漢市中醫院腫瘤科臨床使用多年的協定處方，由水牛角、梔子、陳皮、赤芍、白花蛇舌草、半枝蓮等10味中藥組成，具有解毒、化瘀抗癌、扶正驅邪的功效，用于癌癥晚期止疼抑癌的治療。方中水牛角為君藥，梔子、陳皮、赤芍為臣藥。輔助君藥解毒，扶正抗癌。為了考察解毒抗癌巴布劑的釋放量及透皮率，本實驗以解毒抗癌巴布劑處方中的梔子、陳皮、赤芍中活性成分為考察指標，來研究解毒抗癌巴布劑的透皮性能，同時對解毒抗癌巴布劑給藥后的藥動學進行研究[1]，為臨床治療提供理論及數據支撐。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waterse2695高效液相色譜儀(美國，自動進樣器，紫外檢測器：Waters2489)；BP211D電子天平(德國賽多利斯，感量：0.01 mg)；KQ-300DE型醫用數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RYJ-6A型藥物透皮擴散試驗儀(上海黃海藥檢儀器廠)；島津LC-16型色譜儀；艾柯超純水機(EXCEED 型，成都艾柯水處理有限公司)。

1.2試藥 梔子苷對照品(批號：749-201309，中國食品藥品檢定研究院，含量≥98%)；芍藥苷對照品(批號：110736-201438，中國食品藥品檢定研究院，含量≥99%)；橙皮苷(批號：110721-201211，中國食品藥品檢定研究院，含量≥99%)；甲醇為色譜純(國藥控股有限公司)，乙腈為色譜純(美國TEDLA公司)；超純水；自制解毒抗癌巴布劑(批號：18121500)。

1.3實驗動物 SPF級雌性小鼠(6～8周)，體質量(20±5) g，由湖北省疾病預防控制中心動物實驗室提供，合格證號：NO.4200695787，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2008-0030。飼養環境：屏蔽環境，普通維持飼料，自由飲水，室溫(22±3) ℃，相對濕度(55±5)%，12 h光照黑暗循環。

2 條件與方法

2.1色譜條件 色譜柱為依利特Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速：1.0 mL·min-1，流動相：乙腈(A)：0.2%磷酸(B)=15：85；檢測波長：250 nm，柱溫：25 ℃，進樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品混合溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的梔子苷、芍藥苷、橙皮苷對照品適量至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別制成梔子苷、芍藥苷、橙皮苷濃度為202.8，173.4，225.2 μg·L-1對照品混合儲備液，保存備用。

2.2.2供試品溶液的制備 稱取適量的明膠，加水浸泡溶脹制成明膠膠體液，依次加入甘油、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、高嶺土，攪拌均勻制成粘性適中的基質漿料，加入解毒抗癌巴布劑流浸膏，邊加邊攪拌，放置熟化，制成巴布劑膏體，調節好涂布規格，涂布、晾干(減壓干燥下抽干空氣和氣泡)，按規格切割成片。

取解毒抗癌巴布劑一貼(批號：18121501)，除去蓋襯，稱取藥膏約0.2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲提取(120 W，頻率42 kHz)30 min后靜置放冷，補重，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性樣品溶液的制備 分別取解毒抗癌巴布劑的缺梔子、赤芍、陳皮3味中藥，其余按比例稱取，制備成陰性巴布劑，按“2.2.2” 項下供試品溶液的制備方法制備，分別制成缺梔子陰性樣品溶液、缺赤芍陰性樣品、缺陳皮陰性樣品和缺梔子、赤芍、陳皮樣品。

3 方法學考察

3.1專屬性考察 分別取“2.2”溶液制備的對照品混合溶液、供試品溶液，陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣20 μL，并記錄色譜圖，見圖1。通過高效液相色譜圖可知，供試品溶液的3個目標主峰保留時間分別與對照品溶液的主峰保留時間對應一致且無干擾，陰性樣品溶液在相應的保留時間位置無干擾峰出現，表明該方法專屬性良好。

3.2線性關系考察 取“2.2”項下混合對照品儲備液，精密吸取對照品儲備液1，2，3，4，5，10 mL，分別置于50 mL量瓶中，各加入50%甲醇稀釋溶解，定容至刻度，分別制成梔子苷系列濃度為4.056，8.112，12.168，16.224，20.28，40.56 μg·L-1；芍藥苷系列濃度為3.468，6.936，10.404，13.872，17.34，34.68 μg·L-1；橙皮苷系列濃度為4.504，9.008，13.512，18.016，22.52，45.04 μg·L-1的系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣20 μL，分別記錄梔子苷、芍藥苷、橙皮苷峰面積，以進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，分別進行線性回歸，繪制標準曲線，計算回歸方程為：梔子苷Y1=1.578×104X1-3.789×103(r=0.999 7)；芍藥苷Y2=8.79×105X2-1.764×103(r=0.999 6)；橙皮苷Y3=7.89×104X3-5.78×103(r=0.999 8)。結果表明，梔子苷在4.056～40.56 μg·L-1，芍藥苷在3.468～34.68 μg·L-1，橙皮苷在4.504～45.04 μg·L-1濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

3.3精密度考察 取上述混合對照品儲備液，分別精密吸取5 mL，置于50 mL量瓶中，加入50%甲醇稀釋溶解，定容至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果，梔子苷峰面積的RSD為0.74%；芍藥苷峰面積的RSD為0.98%；橙皮苷峰面積的RSD為0.83%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3.4穩定性實驗 取解毒抗癌巴布劑(批號：18121501)，稱取約0.2 g，精密稱定，按上述“2.2”項下供試品溶液的制備成供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時按“2.1”項下色譜條件分別進樣20 μL，分別記錄峰面積，結果梔子苷峰面積的RSD為1.22%(n=6)；芍藥苷峰面積的RSD為1.78%(n=6)；橙皮苷峰面積的RSD為1.09%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

3.5重復性實驗 取解毒抗癌巴布劑(批號：1812-1501)的樣品，分別稱取6份，各約0.2 g，精密稱定，按上述“2.2”項下供試品溶液的制備成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖，計算各組分的平均含量，結果梔子苷、芍藥苷和橙皮苷平均含量分別為1677，2104，3241.5 μg·g-1，分別計算RSD為1.23%(n=6)、1.78%(n=6)、1.95%(n=6)，表明該方法重復性良好。

3.6加樣回收率實驗 精密稱定解毒抗癌巴布劑(批號：18121501)已知含量的解毒抗癌巴布劑6份，各約0.1 g，精密稱定，分別加入適量梔子苷、芍藥苷、橙皮苷對照品，按上述“2.2”項下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算回收率，結果見表1。加樣回收率結果可知，計算RSD分別為1.49%，1.13%，1.58%，表明該實驗結果良好，方法可行。

1.梔子苷；2.芍藥苷；3.橙皮苷。

3.7樣品含量測定 取解毒抗癌巴布劑3批(批號：18121501、18121601、18121701)，按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項下色譜條件進行測定梔子苷、芍藥苷、橙皮苷的含量，結果見表2。

4 釋放度實驗

按2015年版《中華人民共和國藥典》(四部)項下0931關于溶出度與釋放度測定法第四法槳碟法進行操作。用不銹鋼篩網(孔徑2 mm×2 mm)做成網碟2個，精確稱取解毒抗癌巴布劑0.20 g，將其用網碟2個固定，同時使巴布劑藥面朝上，置于500 mL燒杯中部，加入37 ℃的0.9%氯化鈉溶液500 mL，保持恒溫，采用攪拌槳進行勻速攪拌，分別10，30，60，90，120 min時精密吸取100 mL溶液，取樣后分別再注入恒溫0.9%氯化鈉溶液100 mL。

4.1供試品溶液的制備 將5個不同時間點取得釋放液，分別置于蒸發皿中，水浴濃縮至干，殘渣加70%甲醇溶解，定容至5 mL量瓶中，濾過，取續濾液即得。

4.2釋放度測定及結果 將上述不同時間點制備的供試品溶液，按照上述“2.1”項下色譜條件，進樣檢測，記錄峰面積，計算釋放含量，結果梔子苷在10，30，60，90，120 min的累積釋放度分別為12.75%，39.27%，48.76%，67.84%，83.81%；芍藥苷的累積釋放度分別為14.36%，37.55%，52.10%，66.88%，84.17%；橙皮苷的累積釋放度分別為10.27%，36.74%，49.10%，58.22%，79.38%。

5 離體小鼠透皮率測定

取SPF級小鼠，脫頸處死，用8%硫化鈉溶液脫毛，用剪刀從腹部剝離整個皮膚，用0.9%氯化鈉溶液洗凈[2-3]，采用改良的Franz擴散池，將鼠皮背部朝下，腹部皮膚朝上，固定于接收池上，稱取解毒抗癌巴布劑0.20 g，精密稱定，緊貼置于鼠皮膚處，接收池內加滿0.9%氯化鈉溶液，水域恒溫保持在(37±1) ℃，開啟磁力攪拌(設置攪拌速度為200 r·min-1)，分別于2，4，6，8，10，12，24 h，取出接收池中的接收液，同時補充同量的恒溫0.9%氯化鈉溶液(37±1) ℃[2-9]。

5.1解毒抗癌巴布劑供試品溶液制備 分別將6次接收液分別水浴蒸干，殘渣加70%甲醇溶液洗滌，置于1 mL量瓶中，并定容、搖勻，過微孔濾膜，即得。

表2 樣品含量測定結果

5.2離體透皮率含量測定 將上述供試品溶液分別按“2.1”項色譜條件注入高效液相色譜儀，進樣20 μL，檢測，分別計算供試品中梔子苷、芍藥苷、橙皮苷的含量及經皮滲透的動力學擬合，結果見表3，4。

5.3結果 由表4可知，解毒抗癌巴布劑中梔子苷動力學擬合方程中，擬合度最高為0.976，符合Higuchi方程；芍藥苷動力學方程中，擬合度最高為0.964，符合Higuchi方程；橙皮苷動力學方程中，擬合度最高為0.997，符合Higuchi方程。

由圖2結果可知，解毒抗癌巴布劑中離體小鼠透皮率，3個有效成分含量均為逐步緩慢釋放，表明該制劑為骨架型控釋制劑。

6 討論

解毒抗癌巴布劑處方中，方中水牛角為君藥，梔子、陳皮、赤芍為臣藥。輔助君藥解毒，扶正抗癌。其君藥水牛角無具體的含量測定指標，故選擇臣藥梔子、陳皮、赤芍中的有效成分來考察解毒抗癌巴布劑的釋放量及透皮率，同時3個成分含量的測定可用于該制劑的質量控制。

表3 梔子苷、芍藥苷、橙皮苷的離體透皮率測定結果

預實驗考察了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水，乙腈-0.2%磷酸水等不同流動相系統進行洗脫，發現流動相選擇乙腈-0.2%磷酸水時，3個色譜峰可以達到基線分離，然后對其流動相比例進行優選，最終選擇乙腈-0.2%磷酸水=15：85，分離效果最好。

表4 經皮滲透動力學擬合方程

圖2 解毒抗癌巴布劑中梔子苷、芍藥苷、橙子苷累積透皮量-時間變化曲線

通過紫外分光度計對混合對照品進行全波長掃描，在250 nm處，3個有效成分有最大的紫外吸收，故本實驗最終選擇吸收波長為250 nm。

緩釋制劑釋藥主要是溶出原理，擴散原理及溶蝕與擴散、溶出結合作用。骨架型主要有3種類型：溶蝕性骨架片，不溶性骨架片和親水性凝膠骨架片，釋藥機制各不相同。由不可溶解但可溶蝕的蠟質材料制成的溶蝕性骨架片是通過孔道擴散與蝕解控制藥物來釋放。不溶性骨架片的藥物釋放是液體穿透骨架，將藥物溶解然后從骨架的溝槽中擴散出來，故孔道擴散為限速步驟，釋放符合Higuchi方程。