姜黃素異硫脲修飾嘧啶類衍生物1g對結(jié)腸癌細胞自噬和遷移侵襲的影響*

夏芮東，孫加琳，尹瑞娟，隋忠國，

(1.青島大學藥學院，青島 266071；2.青島大學附屬醫(yī)院藥學部，青島 266000；3.中國海洋大學醫(yī)藥學院，青島 266003)

姜黃素是一類從姜黃中提取的植物多酚[1]。大量研究表明，姜黃素具有抑制腫瘤細胞活性、降低遷移侵襲能力、誘導自噬及促進凋亡等作用，具有良好的臨床應用價值[2-4]。但姜黃素具有水溶性較差、生物利用度低、代謝率高等缺點，極大地限制其臨床開發(fā)和使用[5-6]。因此以姜黃素為基礎結(jié)構(gòu)進行合理的結(jié)構(gòu)改造，獲取具有臨床應用價值的抗腫瘤藥物具有較好的研發(fā)前景。本團隊前期通過在姜黃素結(jié)構(gòu)骨架基礎上，先后進行嘧啶環(huán)取代和四甲基異硫脲取代得到了新型異硫脲修飾姜黃素嘧啶類衍生物(簡稱1g)[7]。本實驗通過人結(jié)腸癌HCT116和HT29細胞株開展了1g對結(jié)腸癌細胞增殖、遷移侵襲和自噬的作用研究，并進一步探討其發(fā)揮作用的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 人結(jié)腸癌細胞株HCT116(批號：TCHu99)、HT29(批號：SCSP5032)細胞來自中國科學院細胞庫；1g來自中國海洋大學醫(yī)藥學院；Transwell小室(批號：3422)購自美國Corning公司；CD147克隆載體(批號：G114754)購自長沙優(yōu)寶生物公司；胎牛血清(FBS，批號：FNA500)購自上海依科賽生物公司；RIPA裂解液(批號：P0013E)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012)、CCK-8檢測試劑盒(批號：C0042)購自上海碧云天生物；PI3K抑制劑LY294002(批號：HY-10108)購自美國MCE公司； CD147(批號：A1566)購自武漢Abclonal有限公司；AKT(批號：AF6261)、p-AKT(批號：AF0016)、GAPDH(批號：AF7021)購自江蘇Affinity有限公司；兔抗LC3(批號：2775)購自美國CST有限公司；兔抗PI3K(批號：ab191606)、p-PI3K(批號：ab182651)購自英國abcam有限公司。

1.2實驗儀器 離心機(5415D)購自德國艾本德公司；光學顯微鏡(E100)購自日本尼康公司；超低溫冰箱(DW-86L388J)購自中國海爾公司；微量移液器(3120)購自德國艾本德公司；透射電鏡(Tecnai G2 F20)購自美國FEI公司；電子天平(CPA，感量0.1 mg)購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(MCO-18AIC)購自日本三洋公司。

1.3細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞株HCT116、HT29細胞在含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長，并置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況，2～3 d傳代1次，用0.25%胰酶消化，取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

1.4siRNA序列合成及過表達載體構(gòu)建 siRNA序列合成根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中CD147基因登記號NM_198589.1及siRNA設計原則，使用siRNA在線設計工具(http：//sidirect2.rnai.jp/)設計CD147基因的siRNA(CCUCACCUGCUCCUUGAAU)，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。CD147過表達載體構(gòu)建通過用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamHI將克隆質(zhì)粒pDONR223-CD147與pCMV3.1過表達載體分別進行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物用連接酶連接構(gòu)建CD147-pCMV3過表達載體，構(gòu)建的CD147-pCMV3過表達載體進行DNA測序鑒定。

1.5CCK-8實驗 分別取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的HCT116、HT29細胞，用含10% FBS及1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度到1×105個·mL-1，接入96孔板，每孔100 μL細胞懸液，實驗分2組，即正常組和1g組。其中1g組分別加入不同濃度的1g(1，2，4，6，8，10，12，14 μmol·L-1)，另每組設空白對照孔，每孔重復3次。加藥后37 ℃培養(yǎng)24 h，加藥培養(yǎng)結(jié)束后加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，然后酶標儀測定各孔吸光度值(A450)。

1.6細胞遷移能力的檢測 實驗分為2組，正常組、1g(6 μmol·L-1)組。藥物處理細胞24 h后收集各組細胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞濃度至2×105個·mL-1。在24孔板中加入10%FBS培養(yǎng)基800 μL，并放入Transwell小室，在Transwell上室加入各組細胞懸液200 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。拿出Transwell小室后，通過磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液清洗小室，70%乙醇溶液固定細胞1 h，0.5%結(jié)晶紫溶液染色后室溫下孵育20 min，顯微鏡下觀察攝像。

1.7細胞侵襲能力的檢測 實驗分為2組，正常組、1g(6 μmol·L-1)組。藥物處理細胞24 h后收集各組細胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞濃度至2×105個·mL-1。在24孔板中加入含10%FBS培養(yǎng)基800 μL，并放入Transwell小室，在Transwell上室加入1 mg·mL-1的Matrigel 100 μL后，37 ℃孵育4～5 h，待Matrigel干成膠狀物后于Transwell上室加入的各組細胞懸液200 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。拿出Transwell小室后，通過PBS緩沖液清洗小室，70%乙醇溶液固定細胞1 h，0.5%結(jié)晶紫溶液染色后室溫下孵育20 min，顯微鏡下觀察攝像。

1.8透射電鏡觀察細胞 藥物處理細胞24 h后收集正常組、1g(6 μmol·L-1)組細胞，以2.5%戊二醛和1%鋨酸固定后，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋后制備超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛分別染色5 min，透射電鏡觀察攝像。

1.9Western blotting檢測LC3的表達 實驗分為4組，正常組、低濃度1g(2 μmol·L-1)組、中濃度1g(6 μmol·L-1)組、高濃度1g(10 μmol·L-1)組。通過相應濃度1g處理各組細胞24 h后收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞3次；1500 r·min-1離心半徑r=6.5 cm，離心5 min，棄上清液；隨后加入蛋白裂解液，于冰上震蕩裂解30 min；12 000 r·min-1，離心半徑r=6.5 cm，4 ℃離心20 min后，通過BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。取等量40 μg蛋白樣品以通過凝膠電泳分離，取出凝膠后聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride,PVDF)轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后于5% 脫脂奶粉緩沖液室溫下封閉2 h，隨后將PVDF膜浸泡于用封閉液稀釋的一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜，再在室溫下用二抗孵育2 h，加電化學發(fā)光顯影后掃描膠片，通過ImageJ軟件分析灰度值。

1.10Western blotting檢測CD147、LC3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的表達 實驗分為7組，正常組、1g(6 μmol·L-1)組、CD147干擾組(6 μmol·L-11g+CD147 siRNA)、干擾對照組(6 μmol·L-11g+對照siRNA)、CD147過表達組(6 μmol·L-11g+CD147過表達質(zhì)粒)、過表達對照組(6 μmol·L-11g+對照過表達質(zhì)粒)、CD147過表達+PI3K抑制劑組(6 μmol·L-11g+ CD147過表達質(zhì)粒+ 20 μmol·L-1PI3K抑制劑LY294002)。過表達質(zhì)粒或siRNA轉(zhuǎn)染細胞24 h后，通過6 μmol·L-1濃度1g及20 μmol·L-1PI3K抑制劑LY294002處理相應組細胞24 h后收集各組細胞后，Western blotting法檢測各組細胞中CD147、LC3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的蛋白表達，方法同“1.9”。

2 結(jié)果

2.1CD147過表達載體構(gòu)建鑒定 結(jié)果如圖1所示，構(gòu)建的CD147過表達載體經(jīng)測序分析表明插入的序列正確，目的基因CD147的過表達載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 CD147過表達質(zhì)粒測序鑒定

2.2CCK-8檢測不同濃度1g對HCT116、HT29細胞增殖的影響 由圖2的CCK-8檢測結(jié)果可知，1g能夠抑制人結(jié)腸癌細胞株HCT116、HT29細胞的增殖，隨著濃度的增加，1g對HCT116、HT29細胞的抑制作用逐漸增強。

2.31g對HCT116、HT29細胞遷移及侵襲能力的影響 Transwell遷移實驗結(jié)果見圖3，與正常組相比，1g組HCT116、HT29細胞的遷移能力下降。Transwell侵襲實驗結(jié)果見圖4，與正常組相比，1g組HCT116、HT29細胞的侵襲能力下降。

2.41g對HCT116、HT29細胞自噬的影響 透射電鏡結(jié)果表明，正常組HCT116、HT29細胞質(zhì)中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯自噬體，1g組細胞胞膜輪廓不清，細胞核皺縮，明顯可見自噬體，結(jié)果見圖5。

圖2 不同濃度的1g對HCT116、HT29細胞增殖的影響

A.HCT116細胞正常組；B.HCT116細胞1g組；C.HT29細胞正常組；D.HT29細胞1g。

2.51g對HCT116、HT29細胞中CD147、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、LC3II/LC3I蛋白表達的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，相比于正常組，2，6，10 μmol·L-11g處理HCT116和HT29細胞后細胞中LC3II/LC3I蛋白表達顯著增加(F=2.136，0.633，0.121，P<0.05；F=4.32，0.071，1.401，P<0.05)，呈劑量依賴性，結(jié)果見圖6。另1g(6 μmol·L-1)組與正常組相比，細胞中CD147、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達顯著減少(F=0.004，2.156，1.162，P<0.05；F=3.782，0.574，1.752，P<0.05)；相對于1g(6 μmol·L-1)組，CD147過表達組細胞中CD147、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達顯著性增加(F=0.112，5.313、0.634，P<0.05；F=6.044，0.433，8.25，P<0.05)，LC3II/LC3I蛋白表達顯著減少(F=1.632，P<0.05；F=1.331，P<0.05)，CD147干擾組則呈相反趨勢；相對于CD147過表達組，通過PI3K抑制劑處理后CD147、PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達顯著減少(F=0.003，5.53，2.454，P<0.05；F=0.263，3.313，0.226，P<0.05)，LC3II/LC3I蛋白表達顯著增加(F=0.663，P<0.05；F=1.056，P<0.05)，結(jié)果見圖7，8。

A.HCT116細胞正常組；B.HCT116細胞1g組；C.HT29細胞正常組；D.HT29細胞1g組。

A.HCT116細胞正常組；B.HCT116細胞1g組；C.HT29細胞正常組；D.HT29細胞1g組。

A.正常組；B.低濃度1g組；C.中濃度1g組；D.高濃度1g組；①與正常組比較，P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)較為常見的一種癌癥，其發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中排名第3位，嚴重威脅人們的生活和健康[8]。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率出現(xiàn)了上升趨勢，這一趨勢與不良的生活方式、飲食習慣以及環(huán)境污染等有很大關(guān)系[9]。姜黃素是一類具有開發(fā)成抗腫瘤藥物的多酚類化合物，然而因為姜黃素的水溶性較差、代謝率高等缺點極大地限制了姜黃素的進一步應用[5-6]。1g是本團隊通過嘧啶環(huán)取代和四甲基異硫脲取代得到水溶性高、化學性穩(wěn)定的新型異硫脲取代姜黃素嘧啶類衍生物[7]。本研究CCK-8結(jié)果表明，1g對HCT116和HT29細胞的增殖都有抑制作用，呈劑量依賴性，表明1g有發(fā)展為新藥的潛力。結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移是導致其惡化和復發(fā)的關(guān)鍵原因，嚴重影響患者的生存及預后。自噬與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，研究認為腫瘤細胞的過度自噬能抑制其遷移及侵襲能力[10-11]。與姜黃素對腫瘤的遷移侵襲及自噬方面的作用[12-13]類似，本研究發(fā)現(xiàn)1g作為新型異硫脲取代姜黃素嘧啶類衍生物能夠誘導結(jié)腸癌HCT116和HT29細胞自噬的發(fā)生，對其遷移及侵襲能力有一定的抑制作用。

CD147是細胞表面粘附分子，又叫細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子(extra-cellular matrix metallo proteinases inducer，EMMPRIN)，在多種惡性腫瘤細胞中高表達，其可以通過自分泌的方式增加基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMPS)的合成。高表達的CD147還可刺激纖維母細胞分泌MMPS，促進腫瘤細胞基底膜和間質(zhì)成分降解，并和MMPS形成致密復合物，高度集中在腫瘤細胞膜上，加快腫瘤間質(zhì)的降解，由此促進了腫瘤細胞的浸潤和遷移[14-17]。PI3K/AKT信號通路由PI3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)等分子組成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。PI3K/AKT通路中PI3K主要指I類PI3K(PI3KC I)，它是有一個催化亞基和一個調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，可被G蛋白耦聯(lián)受體、蛋白酪氨酸激酶受體、RAS蛋白等激活。PI3K活化后可產(chǎn)生脂質(zhì)類產(chǎn)物PIP3，PIP3可作為第二信使與含有PH結(jié)構(gòu)域的AKT蛋白結(jié)合使其磷酸化從而活化 AKT，因此p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達高低能體現(xiàn)PI3K/AKT通路的活化程度。激活后的PI3K/AKT通路經(jīng)過一系列的調(diào)控能抑制自噬相關(guān)蛋白LC3表達從而抑制細胞自噬[19-20]。近年來有研究顯示，CD147對腫瘤細胞的自噬具有抑制作用，CD147可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路而影響細胞的自噬[21-22]。FEI等[23]認為CD147與CD98的重鏈在腫瘤細胞膜上可以形成復合物，該復合物可以通過激活PI3K/Akt通路來影響腫瘤細胞的生長，下調(diào)CD147的表達可以進一步降低腫瘤細胞中激活絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT的表達。GOU等[24]研究也顯示，CD147通過影響PI3K/Akt通路的表達而下調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達，進而證實CD147通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)肝癌細胞的自噬。本研究Western blotting檢驗結(jié)果表明，1g能夠抑制HCT116和HT29細胞中CD147表達和PI3K及AKT的磷酸化，誘導細胞自噬。而高表達的CD147明顯逆轉(zhuǎn)了1g的作用，促進HCT116和HT29細胞中PI3K及AKT的磷酸化，激活PI3K/AKT通路。以PI3K抑制劑處理CD147過表達的細胞后，其細胞內(nèi)PI3K及AKT的磷酸化明顯下降，PI3K/AKT通路活化程度降低，說明1g能抑制腫瘤細胞中CD147表達和PI3K/AKT通路。由此，lg有望在結(jié)腸癌的治療中，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，達到減緩腫瘤的發(fā)展的目的，成為新的治療藥物。但其作用效果以及副作用均有待臨床研究和驗證。

A.正常組；B.1g組；C.CD147干擾組；D.干擾對照組； E.CD147過表達組；F.過表達對照組；G.CD147過表達+PI3K抑制劑組；①與1g組比較，P<0.05；②與CD147過表達組比較，P<0.05。

Fig.7ExpressionofCD147,p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKTandLC3II/LC3IinHCT116cells

A.正常組；B.1g組；C.CD147干擾組；D.干擾對照組；E.CD147過表達組；F.過表達對照組；G.CD147過表達+PI3K抑制劑組；①與1g組比較，P<0.05；②與CD147過表達組比較，P<0.05。

Fig.8ExpressionofCD147,p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKTandLC3II/LC3IinHT29cells

綜上所述，抑制CD147及PI3K/AKT通路可能是1g誘導HCT116和HT29細胞發(fā)生自噬，抑制其增殖、遷移侵襲能力的分子機制之一。