柿炭疽病抗性種質調查及發病規律研究

王孟珂,張楊凡,車慶輝,王仁梓,關長飛,楊 勇

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

柿，屬于柿樹科木本植物[1-3]，全世界柿屬植物約有250種，有2500年以上的栽培歷史[4-5]，主要分布于熱帶和亞熱帶，其中作為主產區栽培最多的尤以中國、日本和韓國[6-8]。近年來，以中國長江為界，年產量排名前10的省份南北各占50%。柿起源于中國，為中國特色傳統果種，種質資源十分豐富[9]，由于近些年受一些真菌病害侵染，柿產量受到嚴重影響。其中炭疽病是危害柿樹的一種重要真菌病害，易造成枝葉枯死，果實腐爛變軟，甚至導致整株死亡，嚴重威脅柿產業的發展[10-13]。炭疽菌是侵染多種作物的一類重要的植物病原真菌[14]，且侵染范圍廣，可侵染草莓、葡萄、西瓜、辣椒、茶樹等[15-19]重要經濟作物，從而造成嚴重的經濟損失。

柿炭疽病一般從5月底開始出現，6月至7月上旬發病最為嚴重，然后一直持續到11月中旬的落果期[20]。柿炭疽病在中國主產區均有發生，且不同柿樹品種之間感病程度也有差異，其中陜西的‘富平尖柿’、廣西的‘恭城月神柿’以及從日本引進的‘次郎甜柿’等[21-23]發病嚴重，而廣州的‘雞心黃’和‘陽豐’甜柿發病較少。常見柿炭疽病在枝條、葉片與果實上均有發生，其中葉脈及當年生枝條更易侵染。目前的研究主要集中在炭疽病的發生、病原菌的分離以及綜合防治[24-26]等初步研究，然而，柿種質資源炭疽病抗性鑒定及發病規律缺少系統研究。

本研究將針對國家柿種質資源圃內部分資源進行調查分類，總結炭疽病在柿各部位的發病規律，通過接種試驗，篩選出抗病品種以及感病品種，并進行病原菌鑒定，為柿炭疽病的防治和分子生物學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗以西北農林科技大學國家柿種質資源圃的柿資源為材料，通過連續2 a的病斑觀察，總結炭疽病發病規律。炭疽病侵染選用當年生枝條作為試驗材料，田間侵染從5月底至9月中旬。

1.2 試驗測定項目與方法

1.2.1 田間抗性種質調查 試驗于2017-2018年在國家柿種質資源圃內進行，隨機挑選資源圃內保存的約81份資源進行炭疽病抗性調查以及圃內約837份資源的病株和病果的田間調查，觀察炭疽病發病性狀并總結發病規律。

1.2.2 炭疽病病原菌的分離與鑒定 病原菌的分離采用組織分離法并純化病原菌，組織選用病健交界處。

PDA培養基的制備：200 g土豆去皮切碎，加1 L蒸餾水加熱煮沸，沸騰30 min，用紗布過濾，再次加入蒸餾水補足至1 L，然后加入20.0 g葡萄糖和20.0 g瓊脂，玻璃棒攪拌均勻，加熱至全部融化，最后趁熱用紗布過濾，分裝到三角瓶和培養皿中后滅菌。具體方法參考方中達[27]、楊佳文等[28]方法略作如下修改：①對采取的帶病樣本進行表面的沖洗，流水下沖洗2～3 min；②將大塊組織切割成1～3 cm大小的長度，70%酒精消毒5～10 s左右；③在超凈工作臺中用無菌解剖刀切成5 mm×5 mm的小組織塊，再次用70%酒精浸泡30 s，進行消毒處理；④用4%次氯酸鈉浸泡5～10 min；⑤最后用無菌水沖洗多次，用滅菌的過濾紙吸干水分，接種在PDA培養基，25 ℃倒置培養。

病原菌的鑒定[29-31]：將分離的病原菌提取DNA，然后用ITS和GAPDH基因進行PCR擴增與測序，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成(表1)。25 μL PCR反應體系：2×Reaction Mix 12.5 μL、Golden DNA Polymerase 0.2 μL、模板DNA 1 μL、10 μmol/L上下游引物各 1 μL、ddH2O 9.3 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s(各引物退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，共38個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠檢測后，送往奧科(北京)科技有限公司測序。

表1 引物序列及其退火溫度Table 1 Primer sequence and annealing temperature

1.2.3 田間炭疽病原菌接種 田間采集帶分生孢子的枝條，用無菌水刮洗配制成孢子懸浮液，血球計數板觀察，調節最終孢子液濃度至1×106個孢子/mL，田間接種柿新發枝條，每個處理3～5個枝條，接種后進行套袋保濕，分別于0 d、1 d、 3 d、5 d、7 d、10 d、15 d進行采樣，帶回實驗室拍照，液氮速凍置于-80 ℃冰箱保存，備用。柿果選用感病品種‘富平尖柿’進行接種，套袋保濕觀察其癥狀變化并進行拍照。

1.2.4 室內炭疽病原菌嫩梢接種 田間采集當年生嫩梢，于室內分別做好標記，1×106個 孢子/mL的濃度進行侵染，每個處理3～5個枝條，并給予合適的溫濕度，于接種后3 d、4 d、5 d、6 d、 7 d觀察其癥狀變化。

1.3 試驗測定標準

1.3.1 種質資源抗性鑒定 統計標準按病枝或病果總數占全樹的百分比計算，將植株的抗病性分為5級，分級標準如下：高抗(HR)，發病率在20%以下；中抗(MR)，發病率在20%～49%；感病(S)，發病率在50%～74%；中感(MS)，發病率在75%～89%；高感(HS)，發病率在90%以上。

1.3.2 病株資源分類 按帶病斑枝條數占全樹比例進行分級，從而篩選出主要的抗病和感病資源。分級標準如下：無(0級)，5 a內各級枝條均未發現病斑；輕(1級)，帶病斑枝條數占全樹比例為30% 以下；中(2級)，帶病斑枝條數占全樹比例為30%～60%；重(3級)，帶病斑枝條數占全樹比例為60%以上。

1.3.3 病果資源分類 按帶病斑果實數占全樹比例進行分級，對抗病和感病資源進行補充。分級標準如下：無(0級)，5 a內所保留果實均未發現病斑；輕(1級)，帶病斑果實數占全樹比例為30%以下；中(2級)，帶病斑果實數占全樹比例為30%～60%；重(3級)，帶病斑果實數占全樹比例為60%以上。

1.4 數據分析

利用Excel 2013對試驗數據進行計算處理，Photoshop CS6軟件對圖片進行美化處理，MegAlign工具構建系統進化樹等。

2 結果與分析

2.1 資源圃田間不同抗性種質調查及發病規律研究

2.1.1 國內常見品種炭疽病抗性調查 在陜西主要發病區，于2017年4月到2018年10月連續從資源圃內隨機挑選81種柿種質進行田間感病調查(表2)。參考分級標準對不同抗性種質進行統計劃分，結果顯示中抗品種所占比例較大，如完全甜柿(PCNA)‘上西早生’(日本)和‘羅田甜柿’(中國)等，而高抗品種比例較少，常見甜柿品種‘陽豐’‘禪寺丸’等和完全澀柿(PCA)。

表2 國內常見品種炭疽病抗性調查Table 2 Survey of resistance of common anthracnose in China

2.1.2 病株及病果的總調查 于4月中下旬至11月下旬，通過對國家柿種質資源圃內約837份資源在成熟期和落葉期進行表型觀察，記錄病株數和病果數。發現病株和病果感病程度中，中級(2)和重級(3)所占比例相似，5 a內各級未出現病斑的枝條數量居多。在4月份的展葉期，對資源圃內柿樹各級枝條進行統計調查。在11月下旬的落葉期，進一步進行果實病斑的調查，對抗病和感病資源的篩選進行補充(表3、表4)。

2.1.3 炭疽病發病性狀及規律 炭疽病菌主要侵害柿樹當年生嫩梢、柿葉、柿蒂以及柿果，炭疽病原菌主要以菌絲在枝條病斑內越冬，也可在病果、葉痕和冬芽中過冬。2 a生枝帶病菌率最多，隨枝齡的增加病菌活性逐漸降低。翌年初夏，生出分生孢子，隨風傳播，借雨露萌發入侵。此病菌喜高溫高濕，濕度大時，很容易產生分生孢子團，這些孢子是引起再侵染的主要病源。

侵害枝梢:病原菌入侵嫩枝后，首先出現小黑點，隨后病斑逐漸擴大呈梭形，進而繼續擴大凹陷，并且隨著樹齡的增加，木質化程度加深，病斑凹陷處逐漸變大變黑，嚴重時會使其斷裂。且多年生枝干上的病斑會隨著樹齡的增加，病斑凹陷逐漸擴大加重，出現裂皮(圖1)。

侵害柿葉:葉片發病主要危害葉柄以及葉脈，病斑多發生在近芽口處的葉柄上以及葉背的葉脈上，葉脈發病處以中脈居多。病原菌侵染后，病斑會沿著葉柄處向葉脈延伸，并造成葉片感染，葉片染病處呈黑褐色焦枯狀，嚴重時導致枯萎落葉。空氣濕度大時會在病斑處產生粉紅色的分生孢子(圖2)。

侵害柿蒂:染病初期，柿蒂尖會先出現黑色小斑點，進而病斑逐漸擴大，并向柿蒂中心擴散，嚴重時造成柿蒂皺縮變黑，繼而引起柿蒂和柿果的分離，造成軟果脫落(圖3)。

侵害柿果:感染初期，果實表面出現針點狀病斑，隨著時間的延長，病斑呈橢圓形向周圍延伸，并伴隨病斑處凹陷，而且雨水和露水形成的病斑不同。雨露形成病斑的區別：雨水原因形成的病斑是整片的區域凹陷變黑變軟，露水原因形成的病斑呈水漬般，染病區域凹陷變黑變軟。在空氣比較潮濕時，病斑中心處會涌現大量的粉紅色孢子(圖4)。

2.2 炭疽病原菌分離及初步鑒定

采用組織分離法進行炭疽病病原菌的分離，觀察培養皿內菌落的生長狀況，起初從組織的病健交界處長出絮狀絨毛，后來呈同心圓慢慢擴散，背面灰色或灰褐色，經ITS初步鑒定為炭疽病原菌(圖5)。通過NCBI Blast同源對比，其中有高粱(Q9ZU06.1)、草莓(AAP40268.1)、蒲桃(EQB49331.1)、咖啡果(FJ972602)、芒果(ALP31535.1)、鱷梨(AND76909.1)。

表3 資源圃內病株總調查Table 3 Survey of diseased plants in resources nursery

表4 資源圃內病果總調查Table 4 Survey of disease fruit in resources nursery

結果顯示，此病原菌分離物與炭疽菌同源性高達95%以上。采用MegAlign工具進行系統發育樹的構建，結果顯示，此病原菌分離物與與浙江無核柿(AY787483，AY791890)和次郎甜柿(JQ957543)處在進化樹的同一分支上(圖6)。

A.當年生嫩梢; B.多年生枝干

A.葉柄處; B.葉脈處; C.葉片侵染初期; D.葉片侵染后期

2.3 田間炭疽病原菌接種后的癥狀變化

病原菌接種柿枝葉:從篩選出來的感病和抗病資源中選擇感病品種‘富平尖柿’和抗病品種‘雞心黃’，對這兩種供試材料進行田間炭疽病接種試驗，套袋保濕，每個處理3～5個嫩梢，分別于始日、第1天、第3天、第5天、第7天和第10天采樣，發現感病品種‘富平尖柿’第3天開始出現病斑，隨著時間的推移，病斑逐漸擴大，葉片逐漸減少，在第10天時，枝梢的葉片掉落嚴重，并伴隨枯萎的跡象。而抗病尖柿‘雞心黃’在第5天時才開始出現病斑，且病斑擴散速度較慢，落葉情況不明顯(圖7)。

A.柿蒂侵染初期; B.柿蒂侵染后期

A.柿果侵染初期; B.柿果侵染后期

A.正面菌落形態; B.反面菌落形態; C.分生孢子

圖6 炭疽病原菌ITS序列系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of ITS gene sequence of anthrax pathogen

病原菌接種柿果實:田間選用感病品種‘富平尖柿’進行果實的表面病原菌接種，在黑色記號筆標記處接種配制好的炭疽病原菌孢子液，然后套袋保濕，隨著時間的延長，先出現黑褐色小斑點，隨后病斑逐漸擴大，最終導致非正常落果(圖8)。

2.4 室內炭疽病原菌接種柿嫩梢后的癥狀變化

室內接種經調查發現,在選用的供試材料中，用記號筆做好標記，在標記處進行孢子液的侵染，分別于接種后3 d、4 d、5 d、6 d和7 d觀察，發現感病品種‘富平尖柿’接種后隨著時間的增加，病斑逐漸擴大凹陷，并開始產生粉紅色的分生孢子。而抗病尖柿‘雞心黃’在接種后，隨著時間的推移，標記處表型并無太大變化(圖9)。

A.富平尖柿; B.雞心黃

A.果實接種前期; B.果實接種后期

A.富平尖柿; B.雞心黃

3 討論與結論

柿炭疽病是陜西等主產區的一種重要真菌病害，柿子作為中國主栽品種，近年來各地種植面積也逐年增多，而炭疽病的爆發則大大影響柿產量，危害柿產業的發展。 本研究對國家柿種質資源圃保存的現有資源隨機進行抽樣調查，并按照柿果實脫澀與種子形成的關系[32],分成完全甜柿(PCNA)、不完全甜柿(PVNA)、完全澀柿(PCA)、不完全澀柿(PVA)，根據侵染病原菌后的表型，把他們分成5個等級：高抗(HR)、中抗(MR)、感病(S)、中感(MS)和高感(HS)。同時基于2017-2019的田間調查，對柿資源病株及病果按感病程度分4個級別：無、輕、中、重，初步篩選出關于柿炭疽病的抗性品種和感性品種。并通過田間炭疽病調查總結出炭疽病發病規律：炭疽病原菌主要侵害柿樹當年生嫩梢、柿葉、柿蒂以及柿果，通過菌絲體和分生孢子在發病部位上越冬，其中2 a生枝帶病菌率最多，隨枝齡的增加病菌活性逐漸降低。炭疽病原菌喜高溫高濕，進入春季后，溫度逐漸升高，分生孢子等通過風雨或昆蟲媒介進行傳播，從組織的傷口或表層侵入，濕度大時，更容易產生分生孢子團，這些孢子是引起再侵染的主要病源。本試驗對篩選出的抗性品種‘雞心黃’和感病品種‘富平尖柿’分別進行枝葉噴灑和嫩梢涂刷，接種炭疽病原菌。結果表明，‘雞心黃’發病率極低，對炭疽病病原菌有較好的抗性；‘富平尖柿’普遍感染炭疽病，對發病植株觀察發現，病原菌主要從嫩梢表皮和半木質化枝的皮孔入侵，而完全木質化的枝條卻很難感病。炭疽病原菌隨風傳播，借雨露萌發入侵，并可進行多次侵染。病原菌侵染結果顯示，5月底至7月上旬發病率最高，8月中旬至9月中旬次之。7月中旬到8月上旬侵染率最低，推測高溫可能抑制其病原菌的生長。綜上，本試驗在致病性研究中，從分子角度對炭疽病原菌進行病原菌的分離，通過形態學鑒定并結合柯赫式法則進行ITS序列分析，證明柿炭疽病為炭疽病菌。試驗對柿種質資源圃進行了系統調查分類，總結柿炭疽病發病規律，并分析不同品種的感病機理，為柿炭疽病防治及抗病機理研究提供依據。