玉米自交系對瘤黑粉病抗性鑒定及遺傳多樣性分析

王鐵兵,王 鵬,蔣建軍,王 芳

(甘肅農業大學 農學院，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，蘭州 730070)

玉米(Zeamays)是具有糧、經、果、飼、能等多種用途的重要農作物之一，就種植面積而言已經是中國第一大作物，其總產的增加對全國糧食增產貢獻率位居各大糧食作物之首，可見其增產穩產關系到國計民生。但隨著氣候變暖、耕作制度改變和單一品種大面積種植，病蟲害發生流行嚴重影響了玉米的穩產[1]。

瘤黑粉病(Ustilagomaydis)是玉米大田生產的病害之一，世界上100多個國家和地區均有發生，它是一種由真菌引起的侵害幼嫩組織的局部性病害，發病極為普遍[2]。有研究表明，在18世紀時人們發現導致植物發病的直接原因為活體真菌玉米黑粉菌[3]。被黑粉菌侵染的玉米組織受其代謝產物刺激而產生大小不一、形狀各異的菌瘤，初生菌瘤多為白色或者淡黃色并由表皮組織形成的薄膜所包被，后期所形成的黑粉瘤消耗大量的養分，導致植株空稈不結實，造成嚴重減產[4-5]。在美國，瘤黑粉病導致玉米每年減產1%至5%，并且流行年份不低于10%；在德國，田間自然發病率1%至3%，1976年發病率甚至超過了50%，使玉米產量損失嚴重[6-7]。在中國，由于推廣的玉米品種中缺少抗瘤黑粉病的品種，加上連年連作，秸稈還田，土壤中黑粉菌的厚垣孢子大量積累，致使玉米瘤黑粉病在東北、華北和黃準海等玉米主產區普遍發生[8]。2000年中國內蒙古曾經發生過該病害，當時田間發病率約20%，部分地塊甚至絕收；2012年在東北和華北等玉米主產區，大約有7.2×105hm2玉米感染瘤黑粉病[3,9]。玉米被黑粉菌侵染發病后，一般沒有有效的挽救措施，而積極培育和不斷挖掘開創抗病品種才是重中之重。種植抗病品種是防治該病害最經濟最有效的途徑，據報道，國內外很多學者對瘤黑粉病進行了研究與分析，楊克澤等[10]利用藥劑對種子進行包衣防瘤黑粉病處理，發現28%滅菌唑和24%噻呋酰胺具有良好的防治效果；姜曉穎等[11]對中國東北地區21個主要玉米自交系進行瘤黑粉病抗性評價，發掘出‘沈139’等9個高抗自交系；嚴理等[12]對不同用途的22個玉米品種進行瘤黑粉病抗性鑒定，結果發現糯玉米全為抗性，其次是飼用玉米抗性較好，甜玉米抗性最弱；白金鎧等[13]研究發現抗瘤黑粉病的自交系較多，雜交種中則較少；Lubberstedt等[14]采用RFLP標記法對玉米進行瘤黑粉病進行QTLs分析，檢測到5～10個QTLs；Ding等[15]利用‘綜3’和‘87-1’構建的重組自交系發現，抗瘤黑粉病基因與環境互作效應明顯。目前，雖然篩選出了一些抗病的種質資源，但是這些種質資源的遺傳背景尚未得到進一步分析。SSR具有豐富的多態性、良好的穩定性、操作簡單等優點，廣泛應用于玉米、水稻、小麥等農作物的種質資源親緣關系分析，遺傳圖譜構建等方面的研究[16]。因此，本研究對30份玉米種質資源進行瘤黑粉病的抗性鑒定，并對其遺傳背景進行SSR分析，以期篩選出抗瘤黑粉病的育種材料，為玉米抗瘤黑粉病基因發掘與種質改良工作提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

‘KYS旱17-9’‘C0343’和‘KYN01’等32份玉米自交系為材料，均由甘肅農業大學平涼玉米育種站自選提供(表1)。

表1 供試玉米自交系名稱Table 1 Maize inbred lines

1.2 試驗地點與田間設計

試驗于2018年在甘肅省定西市安定區鳳翔鎮進行(E 104°62′，N 35°58′)，該地區光能豐富，雨熱同季(主要集中在6、7、8月)，無霜期 140 d左右，年平均日照時數2 500 h，2018年降雨量479 mm，其中6、7月份的降雨量197.9 mm；2019年降雨量(1-11月)477 mm，其中6、7月份的降雨量183.4 mm。前茬為馬鈴薯。

試驗小區采取隨機分布，每份材料種植2行，每行留苗25株，重復3次，對照為‘齊319’(高抗)和‘掖478’(高感)，2019年重復鑒定。

1.3 用于鑒定種質遺傳資源的SSR引物

引物來源于Maize GDB網站(http://www.maizegdb.org)公布的SSR引物信息情況，選擇分布在玉米10條染色上不同bin的69對SSR標記，由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。

表2 SSR引物名稱與序列Table 2 Name and SSR sequence

(續表2 Continued table 2)

1.4 供試病原菌與田間接種

秋季從病株上以圖1-B為標準采集瘤黑粉病菌，陰晾風干后放于紙盒內保存。采用張春民等[17]的注射法接種，使用時將冬孢子充分碾碎，過40目篩后收集均一菌粉，每25 g菌粉加水1 L，充分攪拌后300目篩網過濾，并對濾液加水補足至1 L，備用(現用現配)。

接種時期在玉米植株6葉1心期，用注射器吸取制備好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1 mL，見心葉冒液即可，對照組在相同部位注射等量的蒸餾水。

1.5 調查內容及標準

1.5.1 調查內容與抗性等級評價標準 接種第10天和第20天進行田間發病情況調查。調查項目包括：每系總株數、發病株數、發病率(以第20天的調查發病率結果進行抗性等級評價)。玉米瘤黑粉病抗性鑒定依據《玉米抗病蟲性鑒定技術規范》(國家行業標準)進行評價[18]，其具體劃分為1-9級：1級為高抗(HR)，病株率為0～ 1.0%；3級為抗病(R)，病株率為1.1%～ 10.0%；5級為中抗(MR)，病株率為10.1%～ 20.0%；7級為感(S)，病株率為20.1%～40.0%；9級為高感(HS)，病株率為40.1%～100%。

1.5.2 DNA的提取與PCR擴增 在玉米3葉1心時取玉米葉片貯藏在-80 ℃冰箱中備用，采用CTAB法提取DNA[19]；SSR分子標記的PCR反應體系為：(1)2×TaqPCR Master Mix 5 μL；(2)上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；(3)模板DNA(50 ng/μL)2 μL；(4)滅菌超純水2 μL，總體積為10 μL。PCR擴增程序為：(1)95 ℃預變性 5 min；(2)94 ℃變性30 s，50～59 ℃退火30 s， 72 ℃延伸40 s；(3)步驟“(2)”進行35個循環；(4) 72 ℃延伸10 min。用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增后的PCR產物進行檢測，檢測結果如圖2所示。

圖1 玉米瘤黑粉典型照片Fig.1 Typical photo of Ustilago maydis

圖2 SSR引物umc1555和nc130凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of SSR primers umc1555 and nc130

2 結果與分析

2.1 不同玉米品種的發病率情況

由表3可知，對6葉1心期的玉米幼苗在接種黑粉菌后的第10天，都表現出瘤黑粉病的癥狀。30份材料的發病率情況不同，發病率為 3.33%～53.33%， ‘鋒967-2硬長’的發病率最低，為3.33%；‘XZX674-2半’發病率最高，為 53.33%。在接種后的第20天，所有材料都發病，并進入發病增速期，發病率為10.00%～ 86.67%，‘鋒967-2硬長’的發病率最低，為 10.00%，‘10玉1172-1’發病率最高，達86.67%。在接種后的第20天，發病率≥50%的有13份材料，占供試材料的40.63%，此后發病率沒有增長。

表3 不同玉米材料發病率情況Table 3 Incidence of different maize varieties

2.2 不同玉米品種的發病株率與抗性等級

在接種后的第20天，通過30份玉米種質資源對瘤黑粉的田間抗性鑒定發現，不同玉米種質對玉米瘤黑粉病具有不同程度的抗性(表4)，其中‘鋒967-2硬長’表現為抗瘤黑粉病，占供試 材料的3.33%； ‘XZX5221-1’‘Q6196-6-1-1’‘10ZX-1418張’‘FN296-2’‘FN119-5’和‘10玉39’表現為中抗瘤黑粉病，占20.00%；‘KYN01’‘Q529-1-2長’‘XFN無名13-3’‘Q6193-3-14’‘FN95-1馬’‘FN25-2硬’‘Q6193-3-1-2’‘Q416-1-21’和‘10HN17’表現為感瘤黑粉病，占 23.33%；‘KYS旱17-9’‘C0343’‘FN張’‘XZX513’‘10ZX123’‘10H101445’‘10玉1172-1’‘FNA30-1半’‘Q518-22S’‘26193-3-1-2’‘10ZX869-11’‘1048-2硬長’‘XZX674-2半’和‘10HN1383-11硬’表現為高感瘤黑粉病，占 46.67%。其中，‘鋒967-2硬長’的抗性最高，‘10玉1172-1’的抗性最弱。

表4 不同品系玉米的發病株率與抗性等級Table 4 Incidence and resistance levels of different strains of maize

2.3 SSR分子標記的多態性

篩選出具有多態性且擴增條帶良好的69對SSR引物，對32份玉米種質資源擴增結果進行統計分析(表5)。共檢測到272個等位基因，等位變異幅度為3～6，平均每個標記3.64個，引物phi109275和umc1555檢測到的變異最多為6個，引物phi227562、phi046和phi072等檢測到的變異位點最少為3個。多態性信息量為0.435～0.846，平均0.764，其中引物 umc1196最大，為0.846；引物umc1545最小，為0.245。

表5 69對SSR引物多樣性統計Table 5 Diversity statistics of 69 SSR markers

2.4 聚類分析

由圖3可知，對30份玉米種質資源與‘齊319’和‘掖478’進行遺傳聚類分析可知，32份種質資源的遺傳相似系數為0.615～1.000。當遺傳相似系數為0.643時，將32份玉米種質資源分為 4類，第Ⅰ類19份材料，其中包括1份高抗材料‘齊319’，1份抗病材料‘鋒967-2硬長’‘XZX5221-1’‘Q6196-6-1-1’和‘10ZX-1418張’等6份中抗材料；第Ⅱ類有7份材料，其中有6份感病材料和1份高感病材料‘掖478’；第Ⅲ類和第Ⅳ類各含有3份材料，均為高感材料。

3 討論與結論

育種材料的抗病性鑒定，對育種效率的提高和種質資源的利用具有重要意義，因此國內外的玉米育種專家十分重視種質資源的收集，不斷挖掘新的抗病材料，以滿足玉米抗瘤黑粉病育種的需求，從而為培育出更有針對性的新品種，防止病害的廣泛流行奠定基礎[21]。本研究采用多年的鑒定方法，所鑒定出的抗性種質對應用于育種生產有更高價值。研究篩選鑒定出7份抗瘤黑粉病的種質材料，其中‘鋒967-2硬長’的抗性最好，達到抗病水平；鑒定得到的7份抗性材料可為抗病基因定位、克隆等更進一步的研究提供基礎材料，并為抗瘤黑粉病品種的培育提供可選擇抗源，從而拓寬抗瘤黑粉病種質資源的遺傳背景。例如可以配制‘鋒967-2硬長’ב10玉1172-1’的雜交組合，利用雜種優勢選育出抗病品種，且隨著抗性的進一步穩定與提高，可以作為一個比較好的抗瘤黑粉病的品種。此次鑒定表明，感病材料所占比例明顯高于抗病材料，這與嚴理等[12]對玉米品種對瘤黑粉病抗性的鑒定結果一致。要得到高抗種質，除大范圍收集與篩選高抗種質外，還可通過種質創新或改良，解決現有種質資源中抗病種質匱乏的限制，打破抗源單一遺傳背景的現狀，以實現對玉米瘤黑粉病的有效控制。目前，中國玉米種質資源雖然豐富，但沒有發現對瘤黑粉病完全免疫的材料。因此發掘新的抗瘤黑粉病的種質材料，并對這些種質材料的抗病性等進行明確劃分顯得尤為重要[19]。

種質資源親緣關系的研究是種質資源利用的必要前提，豐富的遺傳資源是玉米育種的基礎，確定種質資源的遺傳多樣性程度和親緣關系遠近是育種的關鍵，遺傳的同源性越低，遺傳基礎越寬，對雜交育種越有利，使玉米育種材料選育和推廣更有針對性。SSR標記具有信息量豐富、穩定性好等優點，已成為遺傳育種和資源分類研究中應用最廣泛的分子標記[22-24]，這對指導合理劃分優勢群體，建立相應的雜交育種模式，提高玉米抗瘤黑粉病育種效率具有重要意義。張思奇等[25]對59份玉米種質進行穗腐菌的抗性評價，并利用6對SSR將59份玉米種質劃分為8個組群，第1類群體中含有的4份種質，均為抗病；陳永坤等[26]對64份玉米自交系進行粗縮病的抗性鑒定，采用70對SSR引物對64份玉米自交系進行聚類分析，將供試自交系劃分為 6個群體，其中第1和第4類群中含有的抗病自交系較多；王艷梅等[27]對中國40份玉米自交系進行絲黑穗病的抗性鑒定，采用57對SSR引物對40份自交系進行聚類分析，將40份自交系分為5類，抗病材料主要集中在第5類群。對于玉米瘤黑粉病抗性鑒定的種質進行聚類分析的研究未見相關報道，本試驗利用69對 SSR引物對2個標準測驗種和30份材料進行聚類分析，將32份玉米種質資源在遺傳相似系數為0.643時分為 4類，說明這些材料有比較豐富的遺傳變異，對抗病育種的選擇和利用提供有效的參考信息。但抗瘤黑粉病的種質材料全部集中在第Ⅰ類，這些抗性材料遺傳基礎狹窄，距離差異小。這主要是因為品種選育過程中所用親本使用過度，育種材料的遺傳差異很小，親緣關系較近，導致了大田生產中所用的抗瘤黑粉病品種的遺傳背景狹窄[16]，對環境的適應力和對病害的抵抗力下降。所以在抗病育種過程中，要深入挖掘種質資源的親緣關系，減少使用親緣關系較近的材料作為親本，應該利用不同遺傳背景的材料作為親本，以增強品種對環境的適應能力，提高其對病害的抵抗力。

利用SSR分子標記研究玉米種質資源的遺傳多樣性，可對育種方法提供參考信息，為提高育種歷程提供可靠的分子依據。胡德分等[28]采用61對SSR引物在84份玉米材料中擴增出622個等位基因位點，平均每對引物檢測到的等位基因位點為10.23個，多態性信息含量平均為0.779；陳波[29]以30份特異玉米地方品種和 2份玉米骨干自交系為材料，用83對SSR引物共檢測出475個等位基因，平均每對引物檢測到的等位基因位點為10.1個，多態性信息含量平均為 0.626；趙旭等[30]用70對SSR引物在96份玉米材料和6個國內通用的標準測驗種中擴增出213個等位基因位點，平均每對引物檢測到的等位基因位點為3.610個，多態性信息含量平均為0.670。本試驗采用69對SSR引物對32份種質資源進行擴增，一共分析篩選出272個等位基因，平均每個標記3.64個，多態性信息量為0.435～0.846，平均 0.764，相比以上研究，本研究所檢測到的多態性信息量較為豐富，表明本試驗所用的種質材料遺傳多樣性較高，可為抗瘤黑粉病的品種選育等研究提供參考。